[12]发明专利申请公开说明书
[21]申请号038247.1
[51]Int.CI.
C07C 57/00 (2006.01)
[43]公开日2006年5月17日[22]申请日2003.03.27[21]申请号038247.1
[86]国际申请PCT/IN2003/000091 2003.03.27[87]国际公布WO2004/085366 EN 2004.10.07[85]进入国家阶段日期
2005.11.11
[11]公开号CN 1774413A
[74]专利代理机构上海浦一知识产权代理有限公司
代理人丁纪铁
[71]申请人科学工业研究委员会
地址印度新德里
共同申请人尤那尼医学地区研究院
[72]发明人穆罕默德·亚辛·达 穆罕默德·约瑟
夫 玛什塔科·埃·库里什 恩尼斯·埃·安萨莉 什姆希德·阿默德 亚伯都尔·萨米·肖尔 阿吉特·库玛·萨克席那 古拉姆·纳比·卡吉
权利要求书 7 页 说明书 18 页
[54]发明名称
抗癌二萜化合物、其制备方法及应用
[57]摘要
从Lavatera cachmeriania(花葵属)中分离出来的两种化合物即对映石松脂烷8(14)、15－二烯－19酸(15－diene－19 oic acid)(化合物1)和对映石松脂烷7(8)，9(11)与15－二烯－19酸(15－diene－19 oic acid)(化合物2)在体外能显著地抑制人类癌细胞系的生长，这些癌细胞系出现在不同的组织器官，如：中枢神经系统(CNS)：SK－N－MC，肠(Colon)：HT－29，肺(Lung)：A－549，肝(Liver)：Hep－2，卵巢(Ovary)：OVCAR－5，前列腺(Prostate)：PC－3。
038247.1
权 利 要 求 书
第1/7页
1、从锦葵科花葵属植物花葵(Lavatera cachmeriania)中分离的两种名为对映石松脂烷8(14)，15-二烯-19酸(1)和对映石松脂烷7(8)，9(11)，15-二烯-19酸(2)的新化合物。
化合物1
化合物2
2、如权利要求1所述的化合物具有以下特征： 化合物(1)： m/z：302(M+) IR(vmax)：3552-3228(O-H)；1684(C＝O)；1598；1410和910(三基取代双键)和12，
-1
1024，860(二基取代双键)cm
2
038247.1权 利 要 求 书 第2/7页
UV(λmaxMeoH)：215nm
113
化合物(1)的H-NMR和C-NMR：
表1：化合物1的H-NMR化学位移(200MHz，CDCl)
3
1
完整的质子
δ
编码
0.651.011.252.162.314.904.955.72
13
多样性J in Hz分配
3332H1H1H1H1H
SSSdd，brdd，brDdSDd
--
-H-18H-20H-17H-7H-9Ha-16H-14H-15
6，56，76，7-6，7
表2：化合物1的C-NMR，500MHz碳编号1234567.8.9.10
δc39.319.337.9844.156.224.235.8138.050.638.56
碳编号11121314151617181920
δc19.636.538.5128.0147.2113.029.429.2184.513.3
化合物(2)：
+ m/z：300(M)
IR(νmax)3520-2880(OH)；1678(CO)；νmax 1440；1408；1330；1184；1092；910 and
-1
756(三基取代双键)cm
MeoH
UV(λmax)：240nm
113
化合物(2)的H-NMR andC-NMR：
表3：化合物2的H-NMR化学位移(200MHz，CD Cl)
31
完整的质子
δ
编码
0.651.09110
333
sss
-H-18H-20H-17
多样性
J in Hz
分配
3
--
038247.1权 利 要 求 书 第3/7页
1.48-1.521.382.315.625.752.142.152.044.944.884.91
13
6H1H1H1H1H1H1H2H1H1H1H
m，brdddd，brddddbr，dd，brs，brtdd
-3.3，7.35，87，47.3，3.555-5，22.065
H-1H-5Ha-6H-7H-11Ha-12Hb-12Ha-14Hx-15Ha-16Hb-16
表4：化合物2的C-NMR，500MHz碳编号12.3.4.5.6.7.8.9.10.
δc39.619.636.244.456.532.3120.3146.18138.239.6
碳编号1112.131415.16.17.18.1920.
δc138.438.938.330.1147.5113.329.529.7185.214.1
3、一种如权利要求1所述的化合物的分离方法，它包括如下步骤： (a)将植物Lavatera Cachmiriana的部分研成粉末，
(b)采用一种有机溶剂对上述步骤(a)制成的植物粉末进行脱脂， (c)用一种醇溶剂提取步骤(b)脱脂的植物原料，以获得醇萃取物， (d)在减压下蒸发步骤(c)获得的醇萃取物，以得到干燥提取物，
(e)用硅胶柱层析纯化步骤(d)的干燥提取物，再用一种有机混合剂进行洗脱， (f)以硅胶薄层层析(TLC)分析为基础对步骤(e)获得的相同洗脱部分进行汇集，再浓缩汇集的成分以减少体积，然后加入一种有机溶剂使其结晶，最后得到所需的化合物(1)和(2)。
4、如权利要求1所述的方法，所述的步骤(a)使用的植物部分是全株植物。
4
038247.1权 利 要 求 书 第4/7页
5、如权利要求1所述的方法，所述步骤(b)使用的有机溶剂可选择石油醚或(正)己烷。
6、如权利要求5所述的方法，所述的有机溶剂是石油醚。
7、如权利要求1所述的方法，所述步骤(b)中的植物原料和有机溶剂的质量与体积比(w/v)的范围是1∶20～25。
8、如权利要求1所述的方法，所述步骤(c)中使用的醇溶剂是C1到C6的脂肪族醇，它可以从甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、戊醇和己醇这一组醇中选择。 9、如权利要求8所述的方法，所述的醇溶剂是甲醇。
10、如权利要求1所述的方法，所述步骤(c)中的植物原料和醇溶剂的质量与体积比(w/v)的范围是1∶15～20。
11、如权利要求1所述的方法，所述步骤(e)中用于洗脱的有机混合剂是石油醚和乙酸乙酯的混合剂。
12、如权利要求1所述的方法，所述的石油醚∶乙酸乙酯的体积百分比(v/v)的范围是98∶2到90∶10。
13、如权利要求12所述的方法，所述的石油醚∶乙酸乙酯为95∶15的混合剂所得洗脱液提供化合物(1)。
14、如权利要求12所述的方法，所述的石油醚∶乙酸乙酯为90∶10的混合剂所得洗脱液提供化合物(2)。
15、如权利要求1所述的方法，所述的步骤(f)中用于结晶的有机溶剂是石油醚。 16、一种药物组合物，包含一种有效量的名为对映石松脂烷8(14)，15-二烯-19酸的化合物(1)，或者包含一种有效量的名为对映石松脂烷7(8)，9(11)，15-二烯-19酸的化合物(2)，或者包含有效量的化合物(1)和化合物(2)的组合，该药物组合物用以治疗受癌症折磨的对象，所述癌症包括肺癌、卵巢癌、中枢神经系统癌、结肠癌、前列腺癌和子宫颈癌。 17、如权利要求16所述的药物组合物，所述的化合物(1)和/或化合物(2)可单独服用，也可与药学上可接受的赋形剂结合后服用。
18、如权利要求17所述的药物组合物，所述的药学上可接受的赋形剂可以是添加剂、载体、稀释剂、溶剂、填充剂、润滑剂、赋形剂、粘合剂或稳定剂。
19、如权利要求16所述的药物组合物，所述的化合物(1)和/或化合物(2)可口服或全身施用。
20、如权利要求16所述的药物组合物，其中，所治疗的病情是由肺癌、卵巢癌、中枢神经系统癌、结肠癌、前列腺癌和子宫颈癌引起的。
5
038247.1权 利 要 求 书 第5/7页
21、如权利要求16所述的药物组合物，所述的对象是动物、哺乳动物或人类，优选人类。
22、如权利要求16所述的药物组合物，所述的包含化合物(1)的药物组合物在10～100μg/ml的浓度下抑制人肺癌细胞(A-549)的生长达到13％～94％。
23、如权利要求16所述的药物组合物，所述的包含化合物(1)的药物组合物在10～100μg/ml的浓度下抑制人肝癌细胞(Hep-2)的生长达到18％～91％。
24、如权利要求16所述的药物组合物，所述的包含化合物(1)的药物组合物在10～100μg/ml的浓度下抑制人卵巢癌细胞(OVCAR-5)的生长达到0％～76％。
25、如权利要求16所述的药物组合物，所述的包含化合物(1)的药物组合物在10～100μg/ml的浓度下抑制人中枢神经系统(CNS)癌细胞(SK-N-MC)的生长达到0％～88％。 26、如权利要求16所述的药物组合物，所述的包含化合物(1)的药物组合物在10～100μg/ml的浓度下抑制人结肠癌细胞(HT-29)的生长达到2％～94％。
27、如权利要求16所述的药物组合物，所述的包含化合物(1)的药物组合物在10～100μg/ml的浓度下抑制人前列腺癌细胞(PC-3)的生长达到5％～97％。
28、如权利要求16所述的药物组合物，所述的包含化合物(1)的药物组合物在10～100μg/ml的浓度下抑制人子宫颈癌细胞(Si Ha)的生长达到0％～41％。
29、如权利要求16所述的药物组合物，所述的包含化合物(2)的药物组合物在10～100μg/ml的浓度下抑制人肺癌细胞(A-549)的生长达到9％～97％。
30、如权利要求16所述的药物组合物，所述的包含化合物(2)的药物组合物在10～100μg/ml的浓度下抑制人肝癌细胞(Hep-2)的生长达到18％～91％。
31、如权利要求16所述的药物组合物，所述的包含化合物(2)的药物组合物在10～100μg/ml的浓度下抑制人卵巢癌细胞(OVCAR-5)的生长达到12％～96％。
32、如权利要求16所述的药物组合物，所述的包含化合物(2)的药物组合物在10～100μg/ml的浓度下抑制人中枢神经系统(CNS)癌细胞(SK-N-MC)的生长达到22％～92％。 33、如权利要求16所述的药物组合物，所述的包含化合物(2)的药物组合物在10～100μg/ml的浓度下抑制人结肠癌细胞(HT-29)的生长达到0％～95％。
34、如权利要求1所述的化合物(1)和化合物(2)的应用，所述的化合物用以治疗受癌症折磨的对象，所述的癌症主要是肺癌、卵巢癌、中枢神经系统(CNS)癌、结肠癌、前列腺癌和子宫颈癌，所述方法包括给所述对象服用一种化合物(1)和/或化合物(2)在配药上的有效剂量，或服用一种含化合物(1)或化合物(2)或其组合的药物组合物。
6
038247.1权 利 要 求 书 第6/7页
35、如权利要求34所述的化合物的应用，所述的化合物(1)和/或化合物(2)可以单独服用，也可与药学上可接受的赋形剂结合服用。
36、如权利要求35所述的化合物的应用，所述的药学上可接受的赋形剂可以是添加剂、载体、稀释剂、溶剂、填充剂、润滑剂、赋形剂、粘合剂或稳定剂。 37、如权利要求34所述的化合物的应用，所述的化合物(1)和/或化合物(2)可以口服或全身施用。
38、如权利要求35所述的化合物的应用，其中，所治疗的病情由肺癌、卵巢癌、中枢神经系统(CNS)癌、结肠癌、前列腺癌和子宫颈癌引起。
39、如权利要求34所述的化合物的应用，所述的对象是动物、哺乳动物或人类，优选人类。
40、如权利要求34所述的化合物的应用，所述的化合物(1)在10～100μg/ml的浓度下抑制人肺癌细胞(A-549)的生长达到13％～94％。
41、如权利要求34所述的化合物的应用，所述的化合物(1)在10～100μg/ml的浓度下抑制人肝癌细胞(Hep-2)的生长达到18％～91％。
42、如权利要求34所述的化合物的应用，所述的化合物(1)在10～100μg/ml的浓度下抑制人卵巢癌细胞(OVCAR-5)的生长达到0％～76％。
43、如权利要求34所述的化合物的应用，所述的化合物(1)在10～100μg/ml的浓度下抑制人中枢神经系统(CNS)癌细胞(SK-N-MC)的生长达到0％～88％。
44、如权利要求34所述的化合物的应用，所述的化合物(1)在10～100μg/ml的浓度下抑制人结肠癌细胞(HT-29)的生长达到2％～94％。
45、如权利要求34所述的化合物的应用，所述的化合物(1)在10～100μg/ml的浓度下抑制人前列腺癌细胞(PC-3)的生长达到5％～97％。
46、如权利要求34所述的化合物的应用，所述的化合物(1)在10～100μg/ml的浓度下抑制人子宫颈癌细胞(Si Ha)的生长达到0％～41％。
47、如权利要求34所述的化合物的应用，所述的化合物(2)在10～100μg/ml的浓度下抑制人肺癌细胞(A-549)的生长达到9％～97％。
48、如权利要求34所述的化合物的应用，所述的化合物(2)在10～100μg/ml的浓度下抑制人肝癌细胞(Hep-2)的生长达到18％～91％。
49、如权利要求34所述的化合物的应用，所述的化合物(2)在10～100μg/ml的浓度下抑制人卵巢癌细胞(OVCAR-5)的生长达到12％～96％。
7
038247.1权 利 要 求 书 第7/7页
50、如权利要求34所述的化合物的应用，所述的化合物(2)在10～100μg/ml的浓度下抑制人中枢神经系统(CNS)癌细胞(SK-N-MC)的生长达到22％～92％。
51、如权利要求34所述的化合物的应用，所述的化合物(2)在10～100μg/ml的浓度下抑制人结肠癌细胞(HT-29)的生长达到0％～95％。
8
038247.1
说 明 书
抗癌二萜化合物、其制备方法及应用
第1/18页
技术领域
本发明涉及从锦葵科花葵属植物花葵(Lavatera cachmeriania)中分离的两种名为对映石松脂烷8(14)，15-二烯-19酸(化合物1)和对映石松脂烷7(8)，9(11)，15-二烯-19酸(化合物2)的化合物。该化合物在体外能显著地抑制不同组织器官的人体癌细胞系的生长，如中枢神经系统(CNS)：SK-N-MC，肠(Colon)：HT-29，肺(Lung)：A-549，肝(Liver)：Hep-2，卵巢(Ovary)：OVCAR-5，前列腺(Prostate)：PC-3。背景技术
癌或瘤在身体的任何地方都能开始恶性的新生长，并在后期能转移到任何别的组织。以细胞无限增殖为特征的癌症，已越来越成为一个大众的健康问题，全世界每年会新增约六百万的癌症患者。在许多国家，癌症是引起死亡的第二大疾病，仅次于心脏疾病。癌症可产生于身体的任何器官，但有些部位比其它部位更易于发生癌症，如乳腺、喉咙、肠、白细胞等。每个癌症是由一个单细胞的繁殖引起的，这个细胞在某个阶段脱离正常的生命程序，成为不受组织器官、能无限增殖的同族细胞，最终出现肿瘤。
在正常细胞向肿瘤细胞转变的过程中，细胞会发生复杂且可遗传的改变，这种改变使肿瘤细胞能决定自己的行为，且很大程度上不受控于正常细胞的生长规律，而在一个生物体中，所有正常细胞的生长都受到规律的精确。这一新获得的所谓“自治”的特性，是肿瘤细胞最重要的一个特征，因为没有这个特征，也就不会产生肿瘤。肿瘤细胞的另一个区别特征是它们缺乏完整的功能。肿瘤细胞与正常细胞相比，有以下几点不同：a)低pH值；b)更加自由、激进；c)肿瘤产生激素肽；d)肿瘤与抗原发生联系；e)钙离子浓度的降低及钾离子浓度的升高；f)不同的钾同位素比率；g)甲基化核苷酸数量的增加；h)细胞质中微量蛋白和粘多糖的浓度增加；i)对外源锌更大的需求；j)生物水含量高。
致癌的许多因素已通过流行病学的研究被阐明，如饮食、环境及处于某些充满化学物质或电磁辐射的工作环境下。因此，就现代工业社会而言，识别各种致癌因素并将其从环境中消除是必要的，也是可能的。
9
038247.1说 明 书 第2/18页
在治疗的历史记载中，科学界几乎所有学科都被征服癌这种绝症的追求和探索深深吸引，尤其是对于天然产物化学家。在19世纪和20世纪，为找到隐藏在这可怕疾病背后的推动力，人们展开大量的研究工作，同时，大量的药物引进用于对抗癌症的威胁。科学家对植物总是很感兴趣，他们能从植物中分离出许多药物，且这些药物可治疗包括癌症在内的不同疾病。此刻，简要地看一些最有效的化疗剂是值得的，它们对于人类和那些正在积极从事抗癌药物的合成与分离的研究人员都是极其重要的。
来自于植物的著名抗癌药物有：从夹竹桃科植物长春花Catharanathus roseus的干燥全草中分离提纯到的长春蔓生物碱、长春碱及长春新碱(Smets，L.A；1994，Anticancer Drugs，5：3-9)，由小蘖科鬼臼属植物盾叶鬼臼(podophyllum peltatum)中可提取鬼臼毒素(Royal societyof chemistry，London，1997)，该毒素还没被应用，但是它的两个半合成配糖、葡糖苷足叶乙甙(Etoposide)和表鬼臼毒噻吩吡糖甙(Tenioposide)已被运用于临床(F.Gago，I drugs，1999，2，309，K.Z.Rana et.al.Pharmacotherapy，1999，19，35)。随后又出现了另一种植物提取的抗癌药物太平洋紫杉醇(paclitaxel)(Rowinsky，E.K.，and Donehowar，R.C.Paclitaxel(Taxol).N.Engl.J.Med.1995，332：1004-1014)。紫杉醇这一复合双萜是从Taxus brevifolia紫杉的树皮中分离到的(A.Endo，J.Med.Chem；1985，28，401)。太平洋紫杉醇和一些关键的前体化合物如浆果赤霉素出现在不同紫杉树种的叶子中(A.Endo.J.Antibiot，1979，32，852)，象多烯紫杉已经为这类重要药物提供了一个主要的、可更新的天然资源。
基于以上的背景，我们集中关注于植物中有效细胞毒素剂的鉴定和分离。几乎还没有任何报道是关于锦葵科花葵属植物花葵(Lavatera cachmeriania)中化合物的分离和特性描述的。Lavatera cachmeriania是一种半常绿、多年生的木本植物，它拥有细长而结实的茎干，柔滑且粉红色的花，常春藤状、多绒毛的中绿色叶子。Lavatera cachmeriania被描述为是植物L.thuringiaca的一个次要变种，但是它的树叶是独特的。Lavatera的20-25个种拥有广泛的地中海分布，一直延伸到英国的西南部，金丝雀分布在阿比西尼亚、中亚和克什米尔，但在澳洲和西伯利亚东部没有这些种系。
然而，人们已知道这类植物具有导泻和抗炎活性(Nazionale dele Ricerche，Economicbotany，Bari，V.25(1)P-107Oct；1998)。从这类植物中分离的化合物有：由种子油分离的二氢锦葵酸(dihydromalvalic acid)(Vickey and J.R.，JAOCS，J.Am oil Chem Soc.Australia 1981，58，731-32)，从植物种分离的环丙烯和二羟基苹婆酸(dihydrostercuklic acids)(脂肪酸)(Vickey and J.R.，JAOCS，J.Am oil Chem.Soc.Australia 1980，57(2)，87-91)，由种子分离的cyclopenoid(Lotti，G.Izzo，R.，1 Ind.Agrar University，Agrar 1993，11(9)，303-8)，所有这些化合
物都显示了活性，却没有抗癌活性。
st
10
038247.1发明目的
本发明的主要目的是提供一种从锦葵科花葵属植物花葵(Lavateracachmeriania)中得到的新化合物，该化合物可抑制人类癌细胞系的生长。 本发明的另一个目的是描述该新化合物的特征。
本发明的另一个目的是评价该化合物抗人类癌细胞的功效。
说 明 书 第3/18页
本发明的另一个目的是提供一种从植物Lavatera cachmeriania中分离所述化合物的方法。
本发明的另一个目的是提供一种抑制人类癌细胞系生长的药物组合物。 发明概要
本发明提供了两种新的化合物，即对映石松脂烷8(14)，15-二烯-19酸(15-diene-19 oicacid)(化合物1)和对映石松脂烷7(8)，9(11)，15-二烯-19酸(15-diene-19 oic acid)(化合物2)。本发明也提供一种从锦葵科花葵属植物花葵(Lavatera cachmeriania)中分离该化合物的方法。本发明还提供包含有效量的化合物1或化合物2或其组合的药物组合物。 发明的详细描述
本发明提供了两种从锦葵科花葵属植物花葵(Lavatera cachmeriania)中分离得到的新化合物，即对映石松脂烷8(14)，15-二烯-19酸(15-diene-19 oic acid)(化合物1)和对映石松脂烷7(8)，9(11)，15-二烯-19酸(15-diene-19 oic acid)(化合物2)，它们的分子结构式如下：
11
038247.1
说 明 书 第4/18页
在本发明的一方面，化合物1具有下列特征： 化合物(1)： m/z： 302(M+)
IR(νmax)：3552-3228(O-H)；1684(C＝O)；1598；1410and 910(三基取代双键)and12，1024，860(二基取代双键)cm UV(λmaxMeoH)： 215nm 化合物(1)的H-NMR和C-NMR：
1
13
-1
表1：化合物1的H-NMR化学位移(200MHz，CDCl)
31
完整的质子
δ
编码
0.651.011.252.162.314.904.955.72
3332H1H1H1H1H
SSSdd，brdd，brDdSDd
---6，56，76，7
H-18H-20H-17H-7H-9Ha-16H-14H-15
多样性
Jin Hz
分配
12-6，7
038247.1
表2：化合物1的C-NMR，500MHz碳编号1234567.8.9.10
δc39.319.337.9844.156.224.235.8138.050.638.56
碳编号11121314151617181920
δc19.636.538.5128.0147.2113.029.429.2184.513.3
13
说 明 书 第5/18页
在本发明的另一方面，化合物2具有以下特征： 化合物(2)：
m/z： 300(M)
+
IR(νmax) 3520-2880(OH)；1678(CO)；νmax 1440；1408；1330；1184；1092；910 and 756(三基取代双键)cm UV(λmax
MeoH
-1
)：240nm
1
13
化合物(2)的H-NMR andC-NMR：
表3：化合物2的H-NMR化学位移(200MHz，CDCl)
31
完整的质子
δ
编码
0.651.091101.48-1.521.382.315.625.752.142.152.044.944.88
3336H1H1H1H1H1H1H2H1H1H
sssm，brdddd，brddddbr，dd，brs，brtd
----3.3，7.35，87，47.3，3.555
H-18H-20H-17H-1H-5Ha-6H-7H-11Ha-12Hb-12Ha-14Hx-15Ha-16
多样性
J in Hz
分配
13
-5，22.06
038247.1
4.91
1H
d
5
说 明 书 第6/18页
Hb-16
碳编号12.3.4.5.6.7.8.9.10.
表4：化合物2的C-NMR，500MHz
δc39.619.636.244.456.532.3120.3146.18138.239.6
碳编号1112.131415.16.17.18.1920.
δc138.438.938.330.1147.5113.329.529.7185.214.1
13
在本发明的另一方面，提供了一种分离对映石松脂烷8(14)，15-二烯-19酸(15-diene-19oic acid)(化合物1)和对映石松脂烷7(8)，9(11)，15-二烯-19酸(15-diene-19 oic acid)(化合物2)的方法，包括如下步骤：
(a)将植物Lavatera Cachmiriana的部分研成粉末，
(b)采用一种有机溶剂对上述步骤(a)制成的植物粉末进行脱脂， (c)用一种醇溶剂提取步骤(b)脱脂的植物原料，以获得醇萃取物， (d)在减压下蒸发步骤(c)获得的醇萃取物，以得到干燥提取物，
(e)用硅胶柱层析纯化步骤(d)的干燥提取物，再用一种有机混合剂进行洗脱， (f)以硅胶薄层层析(TLC)分析为基础对步骤(e)获得的相同洗脱部分进行汇集，再浓缩汇集的成分以减少体积，然后加入一种有机溶剂使其结晶，最后得到所需的化合物(1)和(2)。
在本发明的一方面，本发明提供了一种方法，在该方法中用于分离化合物的植物部分是全株植物。
在本发明的另一方面，用于步骤(b)的有机溶剂可选择石油醚或(正)己烷，优选石油醚。
在本发明的另一方面，步骤(b)中的植物原料和有机溶剂的质量与体积比(w/v)的范围是1∶20～25。
14
038247.1说 明 书 第7/18页
在本发明的另一方面，步骤(c)中使用的醇溶剂是C1到C6的脂肪族醇，它可以从一组醇中进行选择，如甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、戊醇、己醇，优选甲醇。植物原料和醇溶剂的质量与体积比(w/v)的范围是1∶15～20。
在本发明的另一方面，步骤(e)中用于洗脱的有机混合剂是石油醚和乙酸乙酯的混合剂，其中，石油醚∶乙酸乙酯的范围是98∶2到90∶10。
在本发明的另一方面，使用石油醚∶乙酸乙酯为95∶15的混合剂所得洗脱液提供化合物(1)，用石油醚∶乙酸乙酯为90∶10的混合剂洗提所得的洗脱液将提供化合物(2)。 在本发明的另一方面，步骤(f)中用于结晶的有机溶剂是石油醚。
在本发明的另一方面，提供了化合物(1)和(2)的应用，即用以治疗受癌症折磨的对象，这些癌症主要是肺癌、卵巢癌、中枢神经系统癌、结肠癌、前列腺癌及子宫颈癌；所述方法包括给上述对象服用化合物(1)和/或化合物(2)的药物有效剂量，或者是服用含化合物(1)和/或化合物(2)或其组合的处方药。
在本发明的另一方面，提供了一种药物组合物，包含一种有效量的名为对映石松脂烷8(14)，15-二烯-19酸(15-diene-19 oic acid)的化合物(1)，或者包含一种有效量的名为对映石松脂烷7(8)，9(11)，15-二烯-19酸(15-diene-19 oic acid)的化合物(2)，或者包含有效量的化合物(1)和化合物(2)的组合，该药物组合物用以治疗受以下一组癌症折磨的对象，这组癌症包括肺癌、卵巢癌、中枢神经系统癌、结肠癌、前列腺癌和子宫颈癌。
在本发明的另一方面，化合物(1)和/或化合物(2)可被单独服用，也可与药学上可接受的赋形剂结合后服用。
在本发明的另一方面，所用的药学上可接受的赋形剂可以是添加剂、载体、稀释剂、溶剂、填充剂、润滑剂、赋形剂、粘合剂或稳定剂。
在本发明的另一方面，化合物(1)和/或化合物(2)，或其处方药可以口服，也可以在全身施用。
在本发明的另一方面，所述的化合物或其处方药有助于缓解肺癌、卵巢癌、中枢神经系统癌、结肠癌、前列腺癌或子宫颈癌引起的病情。
在本发明的另一方面，所述的处方药可给动物、哺乳动物或人类服用，优选的是人类。 在本发明的另一方面，浓度为10～100μg/ml的化合物(1)或其处方药抑制人肺癌细胞(A-549)的生长达到13％～94％。
在本发明的另一方面，浓度为10～100μg/ml的化合物(1)或其处方药抑制人肝癌细胞(Hep-2)的生长达到18％～91％。
15
038247.1说 明 书 第8/18页
在本发明的另一方面，浓度为10～100μg/ml的化合物(1)或其处方药抑制人卵巢癌细胞(OVCAR-5)的生长达到0％～76％。
在本发明的另一方面，浓度为10～100μg/ml的化合物(1)或其处方药抑制人中枢神经系统(CNS)癌细胞(SK-N-MC)的生长达到0％～88％。
在本发明的另一方面，浓度为10～100μg/ml的化合物(1)或其处方药抑制人结肠癌细胞(HT-29)的生长达到2％～94％。
在本发明的另一方面，浓度为10～100μg/ml的化合物(1)或其处方药抑制人前列腺癌细胞(PC-3)的生长达到5％～97％。
在本发明的另一方面，浓度为10～100μg/ml的化合物(1)或其处方药抑制人子宫颈癌细胞(Si Ha)的生长达到0％～41％。
本发明的另一方面涉及化合物(2)或其处方药的活性，浓度为10～100μg/ml的化合物(2)或其处方药抑制人肺癌细胞(A-549)的生长达到9％～97％。
在本发明的另一方面，浓度为10～100μg/ml的化合物(2)或其处方药抑制人肝癌细胞(hep-2)的生长达到18％～91％。
在本发明的另一方面，浓度为10～100μg/ml的化合物(2)或其处方药抑制人卵巢癌细胞(OVCAR-5)的生长达到12％～96％。
在本发明的另一方面，浓度为10～100μg/ml的化合物(2)或其处方药抑制人中枢神经系统(CNS)癌细胞(SK-N-MC)的生长达到22％～92％。
在本发明的另一方面，浓度为10～100μg/ml的化合物(2)或其处方药抑制人结肠癌细胞(HT-29)的生长达到0％～95％。
本发明的另一方面涉及一种药物组合物，其含有有效量的化合物(1)或化合物(2)或其组合。
以下实施例是为了阐明本发明，而不应被解释为本发明的范围。 实施例1：化合物1和2的分离
1250g全株植物Lavatera cachmiriana被研成粉，再用15升石油醚(60-80°)进行脱脂。脱脂的植物原料再用14升甲醇在索格斯利特抽提器(Soxhlet apparatus)中萃取约48小时，然后，所得的甲醇萃取物经真空干燥处理(140g)。140g.干燥的甲醇萃取物用硅胶柱层析(孔径60-120)分馏。然后分别用含5％乙酸乙酯的石油醚(A)和含10％乙酸乙酯的石油醚(B)洗脱层析柱，(A)最终用于化合物(1)的分离，(B)最终用于分离化合物(2)。
16
038247.1 实施例-1
(A)使用含5％乙酸乙酯的石油醚进行分离(化合物1和2的分离)
说 明 书 第9/18页
收集含5％乙酸乙酯(EtOAc)的石油醚洗脱得的分离液到1000ml后，再将这分离液经重新柱层析。然后，使用增加极性的含2％和5％乙酸乙酯的石油醚洗脱层析柱。由含2％乙酸乙酯的石油醚洗脱的分离液达到1000ml，会显示脂肪酸的出现，并弃掉分离液，再用含5％乙酸乙酯的石油醚洗脱得的分离液达到12,000ml时，会在硅胶薄层层析(TLC)上出现一个有趣的点，再通过蒸馏将分离液的体积减少到15ml，然后，用25ml石油醚和5ml乙酸乙酯使浓缩的分离液中的化合物结晶，从而获得纯化合物并标上化合物1熔点135-36℃。 (B)使用含10％乙酸乙酯的石油醚进行分离：
汇集从层析柱上洗脱下来的1250ml分离液，再通过蒸馏把体积减少到30ml，这浓缩的分离液中有复杂的混合物，需进一步通过重新柱层析分离混合物。使用增加极性的含2％和5％乙酸乙酯的石油醚洗脱层析柱，由含2％乙酸乙酯的石油醚洗脱得的分离液达到585ml，没有显示任何点的出现，弃掉该分离液。接着，用含5％乙酸乙酯的石油醚洗脱，得的分离液达到450ml时，会在硅胶薄层层析(TLC)上出现单个点，再通过蒸馏将分离液的体积减少到15ml，然后，以5ml乙酸乙酯和25ml石油醚作为溶剂使浓缩的分离液中的化合物结晶，从而获得纯化合物并标上化合物2熔点125-26℃。 实施例2
2Kg Lavatera cachmiriana植物材料被研成粉末，再用22,000ml石油醚(60-80°)脱脂。脱脂的植物原料再用20,000ml甲醇在索格斯利特抽提器(Soxhlet apparatus)中萃取约48小时，所得的甲醇萃取物经真空干燥处理，称重得210gms。210gm甲醇萃取物再通过柱层析分离，然后，分别用含5％乙酸乙酯的石油醚(A)和含10％乙酸乙酯的石油醚(B)作为溶剂洗脱层析柱。
(A)使用含5％乙酸乙酯的石油醚分离：收集含5％乙酸乙酯(EtOAc)的石油醚洗脱得的分离液到16000ml，该分离液是复杂的混合物，需通过重新柱层析分离混合物，再使用增加极性的含2％和5％乙酸乙酯的石油醚洗脱层析柱，由含2％乙酸乙酯的石油醚洗脱得的分离液达到1200ml，会显示脂肪酸的出现，该分离液弃掉，再用含5％乙酸乙酯的石油醚洗脱得的分离液达到1500ml时，会在硅胶薄层层析(TLC)上出现单个点，然后，通过蒸馏将分离液的体积减少到10ml。最后，用30ml石油醚使浓缩的分离液结晶以产生一化合物，标为化合物1-熔点135-36℃。
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038247.1说 明 书 第10/18页
(B)使用含10％乙酸乙酯的石油醚分离：汇集从层析柱上洗脱下来的1400ml分离液，再通过蒸馏把体积减少到210ml，这浓缩的分离液中有复杂的混合物，需通过柱层析分离混合物。再使用含2％和5％乙酸乙酯的石油醚洗脱层析柱，由含2％乙酸乙酯的石油醚洗脱，得的分离液达到800ml时，没有出现任何点，该分离液弃掉，接着，用含5％乙酸乙酯的石油醚洗脱得的分离液达到700ml时，会在硅胶薄层层析(TLC)上出现单个点，然后，通过蒸馏将分离液的体积减少到10ml。最后，以石油醚作为溶剂使浓缩的分离液结晶并产生一化合物，标为化合物2-熔点125-26℃。 实施例3
1500gms Lavatera cachmiriana植物材料被研成粉末，再用20,000ml石油醚(60-80°)脱脂。脱脂的植物原料再用17,000ml甲醇在索格斯利特抽提器(Soxhlet apparatus)中萃取约48小时，所得的甲醇萃取物经真空干燥处理，称重得175gms。175gms甲醇萃取物再通过柱层析分离，然后，分别用含3％乙酸乙酯的石油醚(A)和含6％乙酸乙酯的石油醚(B)作为溶剂洗脱层析柱。
(A)使用含5％乙酸乙酯的石油醚分离：收集含2％乙酸乙酯(EtOAc)的石油醚洗脱得的分离液到1350ml，该分离液是复杂的混合物，需通过重新柱层析分离混合物，再使用含2％和5％乙酸乙酯的石油醚洗脱层析柱，由含2％乙酸乙酯的石油醚洗脱得的分离液达到900ml，在硅胶薄层层析(TLC)上没有出现任何点，该分离液弃掉，分离液体积达到1200ml时，会在硅胶薄层层析(TLC)上出现单个点，然后，通过蒸馏将分离液的体积减少到10ml。最后，用30ml石油醚使浓缩的分离液结晶以产生一化合物，标为化合物1-熔点135-36℃。
(B)使用含10％乙酸乙酯的石油醚分离：洗脱下来的分离液达到1050ml，该分离液是混合物，需通过重新柱层析分离混合物，再经蒸馏将分离液的体积减少到15ml。然后，使用含2％和5％乙酸乙酯的石油醚洗脱层析柱，由含2％乙酸乙酯的石油醚洗脱，得的分离液达到900ml时，没有出现任何点，该分离液弃掉，接着，用含5％乙酸乙酯的石油醚洗脱得的分离液达到650ml时，会在硅胶薄层层析(TLC)上出现单个点，然后，通过蒸馏将分离液的体积减少到10ml。最后，以石油醚作为溶剂使浓缩的分离液结晶并产生一化合物，标为化合物2-熔点125-26℃。
18
038247.1说 明 书 第11/18页
化合物1的结构被阐明为对映石松脂烷8(14)，15-二烯-19酸(15-diene-19 oic acid)，且同时附加上结构。化合物1是白色结晶固体，它的液相色谱-质谱(LC-MS)分析显示分子离子峰M+Na在m/z 325.1，且相应的分子质量为m/z 302，分子式为C20H30O2。
羧基基团中的两个氧原子的作用性质进一步通过红外光谱(IR spectrum)被显示，νmax3552-3228cm
-1
-1
+
，(O-H)1684cm
-1
(C＝O)1598，1410 and 910cm
-1
(三个取代的双键)12，1024，
860cm(两个取代的双键)。
化合物1的H-NMR光谱(表1)通过显示在δ4.90(1H，dd，J＝6，7Hz，Ha-16)，4.95(1H，dd，J＝6，7Hz，Hb-16)和5.72(1H，dd，J＝6，7Hz，Hx-15)的情况下连结质子的一种ABX模式，从而揭示化合物1中有环外二基取代双键。该光谱在δ5.14(1H，H-15)时含有一宽的单态，证实在分子内存在一个三基取代双键。 由于化合物1显示其紫外光谱吸收结果为λmax
MeoH
1
215nm，所以可排除分子共轭的存在。
用重氮甲烷制备化合物1的甲酯，证实了化合物1中羧基官能的存在，由于含甲氧基的碳酰基的质子在δ3.63(3H，s)时，化合物1的核磁共振光谱(H-NMR spectrum)上含有共振信号，且该核磁共振光谱显示两个甲基的共振信号向低磁场位移，介于δ0.99(3H，s)和1.19(3H，s)之间。因此，同时附加上被指定的化合物1的分子结构。 药物组合物
依照本发明的实践，包含本发明的新化合物以及药学上可接受载体的药物组合物是可以制备的。本发明的药物制备使天然原料产生协同作用，且本发明令人惊讶的特性是天然原料产生的协同作用表现出惊人的特性和效果。活性成分与载体或添加剂的比例可以是1∶1到1∶100的范围，优选1∶1到1∶10。
本发明的药物组合物可包含生理学上接受的稀释剂，填充剂，润滑剂，赋形剂，溶剂，粘合剂，稳定剂等，可用于药物组合物中的稀释剂包括(但不限于)：磷酸二钙、硫酸钙、乳糖、纤维素、高玲土、甘露醇、氯化钠、干淀粉、糖粉及用于延长释放的药片-羟丙基甲基纤维素(HPMC)。可用于药物组合物中的粘合剂包括(但不限于)：淀粉、明胶及象蔗糖、葡萄糖、右旋糖和乳糖这样的填充剂。
用于本发明的天然和人工胶选自于海藻酸钠、茄替胶、羧甲纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮及美国维格姆(veegum)凝胶。用于本发明的方法的赋形剂选自于微晶纤维素、硫酸钙、磷酸二钙、淀粉、硬脂酸镁、乳糖及蔗糖。所用的稳定剂是多聚糖，如阿拉伯
1
19
038247.1说 明 书 第12/18页
树胶、琼脂、褐藻酸、瓜尔豆胶、黄芪胶、两性剂(？)如明胶及合成与半合成聚合体如卡波姆树脂、纤维素醚和羧甲基角素。
可被使用的溶剂包括(但不限于)：林格氏溶液(Ringers solution)、水、蒸馏水、含50％二甲基亚砜的水、丙二醇(功能水或水)、磷酸盐缓冲液、平衡盐溶液、乙二醇及其它传统液体。
依照本发明方法制备的药物组合物可根据需要全身施用。
全身施用指通过口、直肠、鼻子、皮肤及父母亲的帮助(也就是：内部肌肉、腹膜内、皮下或静脉内)。按照好的临床经验，最优选的是以一种剂量服用药物组合物，该剂量能抑制或防止癌细胞的生长，且不会引起不适当的有害副作用。所述药物组合物可单独服用，也可与其他治疗药物一起作为混合剂服用。
在体外，化合物1对抗人癌细胞系的细胞毒性：
人癌细胞系是从印度浦那的国家细胞科学中心(National center for cell science，Pune，India)或美国国家癌症学院(National Cancer Institute，U.S.A)的弗雷德里克医学博士(Frederick，MD)那里获得。这些细胞在组织培养瓶内的完全生长培养基(含2mM glutamine谷氨酸盐、100μg/ml streptomycin链霉素，且pH 7.4的RPMI-10培养基，使用前需添加10％的无菌胎牛血清和100 units/ml青霉素)中生长，且培养环境是37℃，5％CO2及90％相对湿度的二氧化碳培养箱。用胰蛋白酶(含0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA的PBS溶液)处理培养瓶中处于未汇合时期的细胞，并收集起来，再悬浮于完全生长培养基中。通过锥虫蓝(trypan blue)排除技术挑出存活率超过97％的细胞，这些细胞被用于细胞毒性的鉴定。
将化合物1溶于DMSO(二甲基亚砜)以获得20mg/ml的储存液，该储存液再用含50μg/ml庆大霉素的完全生长培养基进行逐级稀释以获得200μg/ml，60μg/ml和20μg/ml的三种工作测试溶液。
在完全生长培养基中制备所需细胞密度的人癌细胞系悬浮液，再将每种细胞系的细胞悬浮液按对照、化合物1、阳性对照的测试标准分别加入96孔组织培养板中(每孔
100μl)。同时也包括每种细胞系的及测试液浓度的空白孔，其中，所述空白孔中只加入等量的完全生长培养基。这些培养板在37℃，5％ CO2和90％相对湿度的二氧化碳培养箱中培养。这个实验重复三次。
20
038247.1说 明 书 第13/18页
培养24小时后，在实验孔和空白孔中加入不同浓度的化合物1的工作液(100μl)，而所需浓度的阳性对照(100μl)也加入阳性对照的孔中。等量的完全生长培养基加入对照组。
加了测试物质后，培养板再培养48小时(在37℃，5％ CO2和90％相对湿度的二氧化碳培养箱中)，然后，在所有孔内的培养基上面通过用50μl TCA(50％三氯乙酸)的逐级分层来停止细胞生长。再将培养板置4℃培养1小时，使细胞固定地贴在孔的底部，所有孔中的液体用吸液管逐渐吸出并弃掉，然后，用蒸馏水洗涤培养板5次以去除TCA、生长培养基、低分子量代谢物、血清蛋白质等，最后风干培养板。
通过SRB(sulforhodamine B dye)染色来检测细胞生长。首先，在培养板的每个孔中加入SRB溶液(100μl含0.4％ SRB的1％乙酸)，再将培养板室温培养30分钟，然后用1％乙酸洗涤孔5次以迅速去除未结合的SRB，并风干培养板。再在所有的孔中加入100μl Tris缓冲液(Tris-buffer，0.01M，pH 10.4)，然后在机械搅拌器上将培养板轻微搅拌5分钟，光学密度OD值在酶标仪540nm下记录。
由实验组的OD平均值减去其相应空白的OD平均值，所得的值可确定在测试物质存在的条件下细胞的生长状况。同样，在缺乏测试物质(对照组)和存在阳性对照物质的两种条件下，细胞的生长状况也被确定。鉴于在缺乏测试物质的条件下细胞生长率为100％，可以确定在测试物质存在的条件下细胞生长的百分比，同样也可以计算出细胞生长抑制百分比。 已确定化合物1在体外的细胞毒性能对抗代表不同器官的人癌细胞系，如：子宫颈(SiHa)、中枢神经系统(SK-N-MC)、结肠(HT-29)、肺(A-549 & HOP-62)、肝脏(Hep-2)、卵巢(OVCAR-5)及前列腺(PC-3)，这些结果总结在表5中。化合物1显示了所有研究过的人癌细胞系(除HOP-62)的生长受其剂量依赖的抑制，在化合物1的浓度为100μg/ml时，该种抑制的变化范围在41-97％，最有效的是对抗人前列腺癌细胞系PC-3，而对抗人子宫颈癌细胞系SiHa的效果最差。
化合物2的结构被阐明为对映石松脂烷7(8)，9(11)，15-二烯-19酸(15-diene-19 oicacid)，且同时附加上结构。
化合物2的液相色谱-质谱(GC-MS)分析显示分子离子峰在m/z 300，且分子式为C20H28O2，通过香草醛-硫酸实验(Vanillin-H2SO4 test)，表明化合物2为萜类化合物，且通过溴甲酚绿实验(bromocresol green test)，表明其在硅胶薄层层析(TLC)板上是羧酸。 IR＝νmax 3520-2880cm(OH)，1678(CO)，νmax 1440，1408，1330，1184，1092，910 and 756cm(三个取代的双键)
-1
-1
21
038247.1
1
说 明 书 第14/18页
化合物2的H-NMR光谱(表3)通过显示在δ4.88(1H，d，J＝2.06Hz，Ha-16)，4.91(1H，d，J＝5.0.Hz，Hb-16)和4.94(1H，t，J＝5，2Hz，Hx-15)的情况下连结质子的一种ABX模式，从而揭示化合物2中有外环二基取代双键。该光谱在δ5.62(1H，H-7)和5.75(1H，H-11)时含有两个单态，证实在结构中存在两个三基取代双键。 由于化合物2显示其在λmax有一个共轭的发色团。
由于三基取代双键的质子共振信号以一个单态出现，所以三基取代双键最可能的位置在Δ7，8和Δ9，11，乙烯基碳的C-NMR(表4)共振信号出现在δc 120.3(C-7)，δc 146.8(C-8)，δc-138.3(C-9)，δc 138.4(C-11)，113.3(C-16)和147.5(C-15)，且在δ2.31(1H，dd，br，J＝5,8，Hz，H-6)和2.14(1H，br，d，J＝5H-12)时，C-6和C-12上的烯丙基质子的化学位移、多样性及耦合常数都进一步证实了这一结果。
该化合物的质谱显示CO2H和HCO2H易于从分子离子中丢失，从而形成m/z 257的基峰碎片和m/z 256的强峰。
用重氮甲烷制备LK-3的甲酯，证实了化合物2中羧基官能的存在，由于含甲氧基的羧基的质子在δ3.63(3H，s)时，化合物2的核磁共振光谱(H-NMR spectrum)上含有共振信号，且当两个甲基的共振信号介于δ0.99(3H，s)和1.19(3H，s)之间时产生低磁场位移。 在体外，化合物2对抗人癌细胞系的细胞毒性：
人癌细胞系生长到一定阶段收集起来，再完全按实施例3所述方法确定细胞毒性，只是这次使用的测试物质是溶于DMSO中的化合物2，且按实施例3中的相同浓度制备三种工作试验溶液。
已确定化合物2在体外的细胞毒性能对抗与实施例3所述相同的代表不同器官的人癌细胞系，结果总结在表5中。化合物2显示了所有研究过的人癌细胞系(除HOP-62)的生长受其剂量依赖的抑制，在化合物2的浓度为100μg/ml时，该种抑制的变化范围在38-97％，对抗人子宫颈癌细胞系SiHa的效果最差，但是对抗其余癌细胞系都有很高的活性。
表1：化合物1的H-NMR化学位移(200MHz，CDCl)
31
MeoH
240nm有紫外光吸收，所以化合物2的分子中肯定拥
13
1
完整的质子编
δ
码
0.651.01
33
SS
--H-18H-20
多样性
J in Hz
分配
22
038247.1
1.252.162.314.904.955.72
13
说 明 书 第15/18页
32H1H1H1H1H
Sdd，brdd，brDdSDd
-6，56，76，7-6，7
H-17H-7H-9Ha-16H-14H-15
表2：化合物1的C-NMR，500MHz碳编号123456710
1
δc39.319.337.9844.156.224.235.8138.050.638.56
碳编号11121314151617181920
δc19.636.538.5128.0147.2113.029.429.2184.513.3
表3：化合物2的H-NMR化学位移(200MHz，CDCl)
3δ0.651.091101.48-1.521.382.315.625.752.142.152.044.944.884.91
完整的质子编码3336H1H1H1H1H1H1H2H1H1H1H
多样性sssm，brdddd，brddddbr，dd，brs，brtdd
J in Hz----3.3，7.35，87，47.3，3.555-5，22.065
分配H-18H-20H-17H-1H-5Ha-6H-7H-11Ha-12Hb-12Ha-14Hx-15Ha-16Hb-16
23
038247.1
表4：化合物2的C-NMR，500MHz碳编号12.3.4.5.6.7.8.9.10.
δc39.619.636.244.456.532.3120.3146.18138.239.6
碳编号1112.131415.16.17.18.1920.
δc138.438.938.330.1147.5113.329.529.7185.214.1
13
说 明 书 第16/18页
表5：在体外，化合物1&2对抗人癌细胞系的细胞毒性
测试物质
浓度(μg/ml)
细胞系&组织A-549
Hep-2
OVCAR-5
SK-N-MC
HT-29
PC-3
SiHa
HOP-62肺
肺肝卵巢
中枢神经系统
结肠前列腺子宫颈
(生长抑制，％)
化合物1
1030100
化合物2
1030100
5FU
1×10M1×10M1×10M1×10M
-4
137294097197-
206880187091-
006676126796-
007588228592-
02709400709543
0577008394-
0014410083817
000003000000-
三苯氧胺三苯氧胺Mytomycin C
-5
19-00----02
-4
98-100----20
-5
87---78--
24
038247.1说 明 书 第17/18页
化合物1
化合物2
25
038247.1
说 明 书 第18/18页
流程图
26
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