一种快速检测食用油中黄曲霉毒素B1的胶体金试剂板的研制

２０１３年７月　中国粮油学报　Ｖｏ１．２８，Ｎｏ．７　第２８卷第７期　Ｊｏｕｒｎａｌ　０ｆ　ｔｈｅ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｃｅｒｅａｌｓ　ａｎｄ　Ｏｉｌｓ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　Ｊｕ１．２０ｌ３　一种快速检测食用油中黄曲霉毒素Ｂ　的　胶体金试剂板的研制　陈笑笑　桑丽雅　李　康　胡叶军　盛慧萍　（杭州南开日新生物技术有限公司　，杭州３１００２２）　（杭州市质量技术监督检测院　，杭州３１００２２）　摘要　为建立用于快速检测粮油样品中黄曲霉毒素Ｂ　药物残留含量的胶体金免疫层析检测试剂，采　用免疫竞争法，将抗黄曲霉毒素Ｂ　单克隆抗体一胶体金复合物包被在微孔中，并将人工合成的黄曲霉毒素Ｂ，　抗原包被在纤维素膜（ＮＣ膜）表面作为检测线（Ｔ线）。待测样品中的黄曲霉毒素Ｂ　残留物将与ＮＣ膜　上的黄曲霉毒素Ｂ　抗原竞争结合胶体金标记的抗黄曲霉毒素Ｂ　单克隆抗体，并以颜色直观显示检测结果。　检测食用油样品时，灵敏度可达到０．５　ｇ／Ｌ，仅需２０　ｒａｉｎ。试验证明该检测试剂具有较高的灵敏度及很好的　特异性，操作便捷，稳定可靠，可作为黄曲霉毒素Ｂ　残留现场监控的有效快速筛检手段。　关键词黄曲霉毒素半抗原免疫测定胶体金免疫层析　中图分类号：Ｒ１５５．５　文献标识码：Ａ　文章编号：１００３—０１７４（２０１３）０７—００９９—０５　黄曲霉毒素（Ａｆｌａｔｏｘｉｎｓ）是２Ｏ世纪６０年代初发　足现场快速检测的要求，而且检测成本较高。自乳　现的一种真菌有毒代谢产物，其基本结构由一个二　业中被检出黄曲霉毒素Ｍ　事件后，据质检总局公布　呋喃环和一个氧杂萘邻酮组成（即香豆素），主要成　的食用植物油产品抽查情况，广州、深圳等多家食用　分包括６种：即ＢＩ、Ｂ２、ＧＩ、Ｇ２、Ｍｌ、Ｍ２　Ｌ１－２］。黄曲霉　油厂家生产的食用油产品被检出致癌物质黄曲霉毒　毒素的危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作　素超标。因此，建立简单、快速、高效的食用油中　用，严重时可导致肝癌甚至死亡。在天然污染的食　ＡＦＢ　检测方法具有重要的意义。＿５　品中，以黄曲霉毒素Ｂ　（ＡＦＢ，）最为多见，其毒性和　本试验以单克隆抗体（ＭｃＡｂ）和免疫胶体金标　致癌性也最强。生产企业如果使用劣质的原料，如　记技术（ＩＬＴ）为基础，研制了一种食用油中ＡＦＢ　免　发霉的花生、菜籽、玉米等生产食用油，则有可能造　疫胶体金快速检测试剂板，可一步式定性测定食用　成黄曲霉素超标，对消费者的身体健康造成威胁。　油中ＡＦＢ。。试剂的灵敏度等性能优于现有的黄曲霉　黄曲霉毒素危害性大，存在范围广，黄曲霉毒素　毒素免疫胶体金快速检测试剂，具有简单、快速、灵　Ｂ．对农产品的污染，不仅影响了农产品质量，严重威　敏度高、无须辅助仪器设备等优点，适用于大量样品　胁到人民消费安全和身体健康，还降低了农产品的　的初步筛选和现场快速检测。　７ｊ　市场竞争力，影响农产品市场声誉。为了预防黄曲　霉毒素中毒事件的发生，维护人类健康，几乎所有国　１　材料与方法　家和地区都规定了农产品、食品和饲料中ＡＦＢ，的最　１．１材料　大允许含量，并作为强制性检测项目［３　Ｊ。　１．１．１仪器　目前，测定食品中黄曲霉毒素的方法有薄层层　ＢｉｏＪｅｔ　ＸＹＺ３０００型点膜仪：美国ＢｉｏＤｏｔ公司；硝　析法、液相色谱法、放射免疫分析法、酶联免疫法、免　酸纤维素膜（ＮＣ）、胶体金结合垫、样品垫、吸水垫：　疫层析法、微柱筛选法、金标试纸法等。这些检测方　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司；Ｂｒａｄｆｏｒｄ蛋白定量试剂盒：Ｂｉｏ—Ｒａｄ　法大多需要专门的仪器设备并且操作繁琐，无法满　公司；黄曲霉毒素ＥＬＩＳＡ检测试剂盒：美国Ｂｅａｃｏｎ公　基金项目：浙江省公益技术应用研究（２０１０Ｃ３３１８７）　司；酶标微孔：美国Ｃｏｍｉｎｇ公司。　收稿日期：２０１２—０４—２５　作者简介：陈笑笑，女，１９８８年出生，助理工程师，食品安全检测　１．１．２药品和试剂　通讯作者：胡叶军，男，１９８７年出生，本科，食品安全检测　氯金酸（ＨＡｕＣ１　・４Ｈ　０）、黄曲霉毒素Ｂ，标准　１００　中国粮油学报　２０１３年第７期　品、羊抗鼠ＩｇＧ：Ｓｉｇｍａ公司；甲醇、正己烷：华东医药　有限公司；黄曲霉毒素Ｂ。一牛血清蛋白偶联物　（ＡＦＢ　一ＢＳＡ）、抗黄曲霉毒素单克隆抗体：杭州南开　日新生物技术有限公司实验室。　１．２方法　１．２．１　黄曲霉毒素Ｂ　特异性结合抗原的制备及鉴定　１．２．１．１通过衍生化反应，合成ＡＦＢ　羧甲基活化物　１０　ｍｇ　ＡＦＢ。溶于６　ｍＬ［（　（甲醇）：　（水）：　（吡　啶）＝４：１：１）］混合液中，加入２０　ｍｇ羧甲基羟胺半　盐酸盐，８５　ｑＣ回流３　ｈ，室温放置过夜，旋转蒸发仪减　压蒸除溶剂。　所得沉淀物用少量氯仿溶解，以　（氯仿）：Ｖ（甲　醇）＝９：１为展开剂，与标准ＡＦＢ，的展开值Ｒｆ进行　对照，Ｒｆ值为０．２５左右的是ＡＦＢ　的活化物，附值　为０．７５左右的组份是没有转化的ＡＦＢ，，收集活化物　组份，待第二次薄层层析进行纯化。收集ＡＦＢ　活化　物，用少量的甲醇溶解，待用。　１．２．１．２利用碳二亚胺法合成ＡＦＢ　完全抗原　取ＡＦＢ　活化物５　ｍｇ于５　ｍＬ的磨口烧瓶中，加　５　ｍＬ无水二甲基甲酰胺（ＤＭＦ）溶液使其溶解，置于　４℃冰箱中冷却，取５０　ｍｇ碳二亚胺盐酸盐（ＥＤＣ）　溶于１．０　ｍＬ蒸馏水中，取４４　ｍｇ　ＢＳＡ溶于４．０　ｍＬ　０．０１　ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ，ｐＨ　７．４）中，冰箱中　冷却待用。　在磁力搅拌的同时，将０．５　ｍＬ　ＥＤＣ溶液逐滴加　入ＡＦＢ，溶液中，４℃搅拌。避光反应１　ｈ。在反应液　中缓慢滴加ＢＳＡ溶液，继续搅拌反应１　ｈ后，再加人　０．５　ｍＬ　ＥＤＰＣ溶液，４℃下反应１６　ｈ。将产物溶液用　０．０１　ｍｏｌ／Ｌ　ＰＢＳ溶液在４℃下透析７２　ｈ，每１２　ｈ换透　析液１次，用小瓶分装，真空冷冻干燥后，置４。ｃ保存。　１．２．１．３抗原的鉴定　合成的黄曲霉毒素特异性结合抗原（ＡＦＢ　一ＢＳＡ）　稀释成１００　ｐ，ｇ／ｍＬ（蛋白质量浓度），然后做２００—　４００　ｎｍ波长的紫外扫描。比较半抗原、载体蛋白和　偶联物的紫外光谱图，判断偶联是否成功。　１．２．２抗黄曲霉毒素Ｂ。单克隆抗体的制备　按常规方法制备　Ｊ。　１．２．３金标抗体的制备　１．２．３．１胶体金溶液的制备　柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液：取０．０１％　氯金酸水溶液１００　ｍＬ用恒温电磁搅拌器加热至沸　腾，持续搅拌的情况下加入１％柠檬酸三钠水溶液　２．５　ｍＬ，继续搅拌加热１０　ｍｉｎ，溶液呈透亮的红色。　室温冷却，用去离子水恢复到原体积，４℃保存备用。　１．２．３．２黄曲霉毒素Ｂ　单克隆抗体的标记　取已制备好的胶体金溶液１００　ｍＬ，用０．１　ｍｏｌ／Ｌ　碳酸钾溶液调ｐＨ到８．０。边搅拌边加入黄曲霉毒素　Ｂ１单抗２　ｍｇ，搅拌１５　ｍｉｎ，逐滴加入２．５　ｍＬ２５　ｍｇ／ｍＬ　聚乙二醇２０　０００（ＰＥＧ　２０　０００），搅拌２０　ｍｉｎ。　２０　０００　ｒ／ｒａｉｎ离心２０　ｖａｉｎ，弃上清液，加入１０　ｍＬ　ｐＨ　７．４　ＰＢＳ缓冲液（含０．４　ｍｇ／ｍＬ　ＰＥＧ）清洗２次。将　沉淀用５　ｍＬ质量分数为２％ＢＳＡ的ＰＢＳ缓冲液（ｐＨ　７．４）溶解，用０．２２　ｍ无菌过滤器过滤后，４℃保存　备用。　１．２．４　Ｔ线、Ｃ线工作浓度的确定及ｃ线、Ｔ线、金　标抗体包被量配比的确定　１．２．４．１　Ｔ线工作浓度的确定　将包被抗原ＡＦＢ　一ＢＳＡ用稀释液稀释成系列　工作浓度，按常规喷量１．０　ｐ，Ｌ／ｃｍ包被到ＮＣ膜上作　为Ｔ线，同时将羊抗鼠ｔｇＧ稀释成１．２　ｒａｇ／ｍＥ按常　规喷量１．０　ｐ，Ｌ／ｃｍ包被到ＮＣ膜上作为ｃ线，上述　ＮＣ膜烘干后与胶体金结合垫等组装成试纸条，用　０．０１　ｍｏｌ／Ｌ　ｐＨ　７．４的ＰＢＳ滴定，观察Ｔ线显色强度　及显色稳定性情况，通过对Ｔ线的工作浓度的粗调　至细调，最终确定Ｔ线的工作浓度范围。　１．２．４．２　Ｃ线工作浓度的确定　根据Ｔ线工作浓度范围，将羊抗鼠ＩｇＧ设置系列　浓度按常规喷量１．０　ｔｒＬ／ｅｍ包被到ＮＣ膜上作为ｃ　线，与胶体金结合垫组装后，用ＰＢＳ液滴定，选择ｃ　线显色深度适中、比Ｔ线略浅或与Ｔ线一样深的浓　度作为ｃ线工作浓度。　１．２．４．３　ｃ线、Ｔ线、金标抗体包被量配比的确定　在Ｔ线工作浓度范围内，选择一个适中浓度按　常规喷量１．０　ｔｘＬ／ｃｍ包被到ＮＣ膜上作为Ｔ线；将确　定的Ｃ线工作浓度以常规喷量１．０　ｐ，Ｌ／ｃｍ包被到　ＮＣ膜上作为ｃ线；将金标抗体包被到金标微孑Ｌ中，　包被量在０．８—２．０　ｐ￣Ｌ／ｃｍ范围内设置系列浓度；上　述材料组装成试纸条后，用ＰＢＳ液和不同浓度的黄　曲霉毒素Ｂ　标准品液滴定，根据显色情况和试纸灵　敏度，选择适宜的金标抗体包被量。　确定了金标抗体包被量后，再细调ｃ、Ｔ线包被　浓度配比，最终确定ｃ线、Ｔ线及金标抗体的包被量　配比。　１．２．５试剂板各组分的优化、组装　用点膜机把适当浓度的ＡＦＢ　一ＢＳＡ及羊抗鼠　ｌｇＧ喷在ＮＣ膜上，分别作为检测线（Ｔ）和控制线　（Ｃ），在３３℃烘箱干燥１２　ｈ。将制备好的金标记抗　第２８卷第７期　陈笑笑等一种快速检测食用油中黄曲霉毒素Ｂ　的胶体金试剂板的研制　１０１　黄曲霉毒素Ｂ　单克隆抗体包被到微孔中，３３℃烘箱　干燥１２　ｈ。　检测试剂板由ＰＶＣ背衬，及其上按顺序黏着的　样品垫、胶体金结合垫、纤维素膜和吸水垫（图　１）组成。用切割机将贴好的板切割成３．８４　ｅｍ宽的　条，装入模板中制成检测试剂板，再放人带干燥剂的　铝箔袋中密闭储存。　注：１．样品垫；２．胶体金结合垫；３．纤维素膜；４．检测线；　５．控制线；６．吸水垫；７．不干胶；８．ＰＶＣ底板　图１　黄曲霉毒素免疫胶体金快速检测试剂板结构示意图　１．２．６试剂板的操作方法　１．２．６．１样品制备　样本处理过程：吸取１　ｍＬ食用油于５　ｍＬ离心　管中；加入１　ｍＬ正己烷和１　ｍＬ甲醇，剧烈震荡　１　ｍｉｎ，静置１　ｍｉｎ（明显分层）；吸取０．５　ｍＬ上层溶　液于一新的５　ｍＬ离心管中，６Ｏ　ｃＩ＝下空（氮）气吹干。　向吹干的离心管中加入２．５　ｍＬ黄曲霉毒素Ｂ　专用　复溶液，冲洗管内壁，充分溶解残留物后，待检。　１．２．６．２使用方法　吸取１００　待检样品溶液于已包被了金标的　微孔中，用滴管吹打均匀，静置反应５　ｍｉｎ，吸取全部　混合溶液于试剂板加样孔中，加样后开始计时，结果　应在５—８　ｍｉｎ读取，其他时间判读无效，读取结果　时，试剂板应置于观察者正面，如图２右侧所示。　『　圄　质控线　检测线　加样孔结果判读区　加样孔　图２试剂使用方法　１．２．６．３结果判定　当检测试样滴于加样孑Ｌ时，由于毛细作用液体　向前移动。到达Ｔ线时，试样中的黄曲霉毒素Ｂ　与　固定在Ｔ线上的ＡＦＢ，一ＢＳＡ复合物竞争结合抗黄　曲霉毒素Ｂ　单抗一胶体金复合物，可出现以下几种　情况（图３）。　画；画；　圃；画；　；　；　阳性　无效　注：Ｃ：控制线；Ｔ：检测线　阴性（一）：Ｔ线（测试线，靠近加样孔一端）比Ｃ线（对照线）深或　一样深，表示样品中黄曲霉毒素Ｂ１含量低于０．５　ｇ／Ｌ或不含黄曲霉　毒素Ｂｌ残留。　阳性（＋）：Ｔ线比Ｃ线浅，或Ｔ线无显色，表示样品中黄曲霉毒　素Ｂ１含量高于Ｏ．５　ｇ／Ｌ；Ｔ线显色比Ｃ线越浅，表示样品中黄曲霉毒　素Ｂ。含量越高。　无效：未出现Ｃ线，表明不正确的操作过程或试剂板已变质失效。　图３阴阳性结果判定图　１．２．７试剂板灵敏度的测定　添加黄曲霉毒素Ｂ，标准品溶液制备成不同质　量浓度的分析试样溶液：０、０．２、０．５、１、２，３　ｇ／Ｌ，用　检测试剂进行测定，每个试样做３个平行样，５　ｍｉｎ　后观察结果。　１．２．８试剂板特异性的测定　将黄曲霉毒素Ｂ　赭曲霉毒素Ｂ、玉米赤霉烯酮、　伏马菌素分别溶于ＰＢＳ缓冲液（ｐＨ　７．４，０．０１　ｍｏｌ／Ｌ），　各配成５、ｌ０、２０、５０、１００　ｇ／Ｌ的质量浓度，然后用检　测试剂板检测。　１．２．９试剂板假阳性率和假阴性率测定　经ＨＰＬＣ法［９　检测为黄曲霉毒素Ｂ　阴性（黄曲　霉毒素Ｂ　含量均小于０．１　ｇ／Ｌ）和阳性添标样品　（黄曲霉毒素Ｂ　含量均大于０．５　ｇ／Ｌ）的食用油样　品各５０份，用本研究制备的试剂板进行测定，比较　检测结果。　１．２．１０试剂板稳定性测定　用来自同一批次中的不同检测试剂板检测同一　样品，比较检测结果。　将相同批次的试剂板分别于３３℃、室温、４℃密　闭保存３个月，每隔２周分别检测阳性和阴性水产样　品各２Ｏ份。　１．２．１１试剂板与仪器方法的比对　将ｌＯ份不同的油样用本研究制备的试剂板进　行检测，同时用ＨＰＬＣ法进行对比。　２　结果与分析　２．１黄曲霉毒素特异性结合抗原的鉴定　ＡＦＢ　ＢＳＡ和ＡＦＢ　一ＢＳＡ的紫外扫描图谱见　图４。从图谱分析，偶联后ＡＦＢ　一ＢＳＡ的特征吸　收波峰发生偏移，根据吸光度加合性原理，表明偶　联成功。　１０２　中国粮油学报　２０１３年第７期　０．５００　一８：黜　２００　２５０　３００　３５０　４００　４５０　波长／ｎｍ　图４　ＡＦＢ１、ＢＳＡ和ＡＦＢ１一ＢＳＡ的紫外扫描图谱　２．２检测试剂板的制备　将不同质量浓度的ＡＦＢ　一ＢＳＡ、羊抗鼠ＩｇＧ、黄　曲霉毒素Ｂ　单克隆抗体一胶体金复合物分别包被　在纤维素膜和酶标微孔中，反复调试，使最终的　灵敏度达到检测所需的要求。其具体用量如下：黄　曲霉毒素Ｂ，单克隆抗体一胶体金复合物采用ＯＤ值　为１０（包被量１Ｏ　Ｌ／孔）的包被量，检测线ＡＦＢ　一　ＢＳＡ用量为０．８　ｍｇ／ｍＬ（喷量１．０　ｉｘＬ／ｃｍ），控制线　羊抗鼠ＩｇＧ用量为１　ｍｇ／ｍＬ（喷量１．０　ｐ￣Ｉ．，／ｃｍ）。　试验结果表明：①采用不同ｐＨ值５、６、７、８、９、１０　的样品垫对试剂板的灵敏度没有产生明显影响。②　将纤维素膜用各种不同配比的溶液做封闭，发　现试剂条的Ｃ、Ｔ线显色都变浅，但对灵敏度和特异　性没有明显影响，所以最终制备检测试剂时没有采　用封闭的方案。③经过比较发现，若ｃ、Ｔ线的质量　浓度和喷量以及抗体一胶体金复合物的ＯＤ值相同，　采用１２　ｍ和５　ｍ这两种不同孔径的纤维素　膜，后者做成的试剂板灵敏度更高一些。④在制备　好的抗体一胶体金复合物中加入不同比例的蔗糖和　海藻糖，会对胶体金复合物从胶体金结合垫上的释　放能力产生影响，在一定范围内，加入的蔗糖和海藻　糖的比例越高，胶体金复合物释放得越快。　采用半抗原偶联率比较高的ＡＦＢ　一ＢＳＡ做成　的试剂板灵敏度更高，这同偶联比率高的ＡＦＢ。一　ＢＳＡ与黄曲霉毒素Ｂ　单克隆抗体一胶体金复合物　发生反应的能力更强有关。但如果半抗原偶联率过　高，则会出现线条过细，显色梯度不明显，跑板差等　现象，不适用于检测试剂板的研制。　本试剂板采用的检测操作过程中，对比三氯甲　烷、乙腈、甲醇、乙酸乙酯等常规提取剂，发现甲醇的　提取效率较高，价格便宜，且毒性及对环境的影响较　其他试剂小很多，适用于本试剂板的样本提取。样　本提取过程尽量避免使用比较昂贵仪器，采取尽可　能简洁的步骤。通过反复试验，本试剂板最终采用　提取、吹干、复溶的提取方法，通过浓缩提高了试剂　板的检测线。针对不同使用者所需的检测线各异，　本方法中可以通过增加复溶液量，降低试剂板的检　出线。根据使用复溶液量的梯度建立试剂板的检　测线梯度，使同一试剂板可以具有不止一个检测　线。　２．３检测的灵敏度　不同质量浓度的分析试样溶液经试剂板检测，　检测显色结果如图５所示，从图５可以看到随着添加　质量分数的升高，检测线（Ｔ线）显色强度呈梯度递　减。当试样中ＡＦＢ，质量浓度小于０．５　ｇ／Ｌ时，检　测线显色比控制线深或与控制线在肉眼下没有明显　区别。当试样中ＡＦＢ　质量浓度大于等于０．５　Ｌ　时，检测线显色比控制线浅。当试样中的ＡＦＢ　浓度　大于２　ｇ／Ｌ时，检测线完全消失。　由此初步确定，本检测试剂板对食用油中黄曲　霉毒素Ｂ　的最低检测水平（ＬＤＬ）可达到０．５　ｇ／Ｌ。　图５不同浓度标准品滴板后显色变化图　２．４检测的特异性　检测结果见表１，由表１可知，试剂板只针对ＡＦＢ。　有特异性结合，与其他真菌毒素没有交叉反应。　表１　黄曲霉毒素Ｂ。快速检测试剂板的特异性　注：“一”表示阴性，“＋”表示阳性　２．５假阴性率和假阳性率　５０份经ＨＰＬＣ法确证阴性的食用油样品用本研　究制备的试剂板检测，２个样品检测结果为阳性，其　余４８个样品检测结果为阴性，故试剂板的假阳性率　为４％。　５０份经ＨＰＬＣ法确证黄曲霉毒素Ｂ　含量大于　０．５　Ｌ的食用油样品用本研究制备的试剂板检　测，检测结果显示均为阳性，故试剂板的假阴性率　为０。　第２８卷第７期　陈笑笑等一种快速检测食用油中黄曲霉毒素Ｂ。的胶体金试剂板的研制　１０３　２．６试剂板的稳定性　经验证表明，不同批次的检测试剂板测定同一　参考文献　样品，其检测限、控制线的显色时间及颜色深浅和最　终结果判读基本相同。　［１］于师宇，王蓓蕾，谢光洪，等．黄曲霉毒素Ｂ　单克隆抗体　的制备与鉴定［Ｊ］．安徽农业科学，２００８，３６（１３）：５４６５—　５４６６　试剂板分别于３３℃、室温、４℃密闭保存３个　月，每隔２周分别检测阳性和阴性水产样品各２０份，　结果显示随着时间和温度的变化，检测结果均未发　［２］李培武，马良，杨金娥，等．粮油产品黄曲霉毒素Ｂ。检测　技术研究进展［Ｊ］．中国油料作物学报，２００５，２７（２）：７７—　８１　生显著变化。根据３３℃下一天相当于室温下１周计　算，本试剂板可以在室温下保存１２个月　】。。。　２．７试剂板与仪器方法的比对结果　［３］刘然，庞广昌．黄曲霉毒素与食品污染［Ｊ］．食品科技，　２００５（９）：３４—３５　［４］卢守英．黄曲霉毒素Ｂ　胶体金免疫层析试纸条的研制　［Ｄ］．扬州：扬州大学，２０１０　１０份油样经本研究试剂板（ＧＩＣＡ法）和ＨＰＬＣ　法检测，结果见表２，两种方法结果一致。　表２　ＧＩＣＡ和ＨＰＬＣ检测结果的比较　［５］王磊，侯玉泽，胡骁飞，等．黄曲霉毒素的危害及检测方法　研究进展［Ｊ］．河南农业科学，２０１０（２）：１２３—１２７　样品　ＧｌＣＡ　样品１样品２样品３样品４样品５样品６样品７样品８样品９样品１０　一　一　一　一　一　＋　一　一　＋　一　［６］赵飞，焦彦朝，连宾，等．黄曲霉毒素检测方法的研究进展　［Ｊ］．贵州农业科学，２００６，３４（５）：１２３—１２６　ＨＰＬＣ（ＷＥ）０．１２　０．３５　０．０　０．１６　０．０　０．８３　０．０　０．０　１．６８　０．３　注：“一”表示阴性，“＋”表示阳性　［７］谢光洪，于光，肖成蕊，等．黄曲霉毒素Ｂ　免疫检测方法　的新进展［Ｊ］．中国畜牧兽医，２００７，３４（７）：１４５—１４６　［８］黄飚，张珏，马智鸿，等．用双标记时间分辨荧光免疫法同　时检测黄曲霉毒素Ｂ，和赭曲霉毒素Ａ［Ｊ］．卫生研究，　２００９，３８（４）：３８５—３８８　３　结论　本研究研制的检测试剂板，与其他的检测手段　相比，最大的特点是快，可以在２０　ｍｉｎ内得到结果；　整个检测过程无需接触毒性很大的黄曲霉毒素；操　［９］ＧＢ／Ｔ　５００９．２３—２ｏｏ６食品中黄曲霉毒素Ｂ。、Ｂ：、Ｇ　、Ｇ：的　测定［ｓ］．北京：中国标准出版社，２００７　作方便，可实现单个样本检测；检测成本低廉。作为　种快速筛查检测的方法，有利于食品中黄曲霉毒　一［１０］Ｖｅｒｈｅｉｊｅｎ　Ｒ，Ｏｓｓｗａｌｄ　ＩＫ，Ｄｉｅｔｉｒｃｈ　Ｒ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ａ　ｏｎｅ　ｓｔｅｐ　ｓｔｉｒｐ　ｔｅｓｔ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ（Ｄｉｈｙｄｒｏ）ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ　ｒｅｓｉｄｕｅｓ　ｉｎ　ｒａｗ　ｍｉｌｋ［Ｊ］．Ｆｏｏｄ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０００，　１２（１）：３１—４０．　素Ｂ　的检测和监控，具有重要价值。　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ　Ｇｏｌｄ－－－－Ｂａｓｅｄ　Ｄｅｖｉｃｅ　ｆｏｒ　Ｒａｐｉｄ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｆｌａｔｏｘｉｎ　Ｂ　１　Ｒｅｓｉｄｕｅ　ｉｎ　Ｅｄｉｂｌｅ　Ｏｉｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｃｈｅｎ　Ｘｉａｏｘｉａｏ　Ｓａｎｇ　Ｌｉｙａ　Ｌｉ　Ｋａｎｇ　Ｈｕ　Ｙｅｊｕｎ　Ｓｈｅｎｇ　Ｈｕｉｐｉｎｇ　（Ｈａｎｇｚｈｏｕ　Ｎａｎｋａｉ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ｃｏ．，Ｌｔｄ　．，Ｈａｎｇｚｈｏｕ　３　１００２２）　（Ｈａｎｇｚｈｏｕ　Ｑｕａｌｉｔｙ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｓｕｐｅｒｖｉｓｉｏｎ　ａｎｄ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　，Ｈａｎｇｚｈｏｕ　３　１００２２）　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ａｉｍｅｄ　ｔｏ　ｄｅｖｅｌｏｐ　ａ　ｒａｐｉｄ，ｓｉｍｐｌｅ　ｃｏｌｌｏｉｄａｌ　ｇｏｌｄ　ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ　ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｆｌａｔｏｘｉｎｓ　Ｂ１．Ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　ｗａｓ　ａｐｐｌｉｅｄ．Ｉｍｍｕｎｏｇｏｌｄ　ｗｅｌｌｓ　ｗａｓ　ｃｏａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ａｎｔｉ—　ａｆｌａｔｏｘｉｎｓ　Ｂｌ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ—ｎａｎｏｃｏｌｌｏｉｄａｌ　ｇｏｌｄ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ，ａｎｄ　ａｒｔｉｉｆｃｉａｌ　ａｆｌａｔｏｘｉｎｓ　Ｂ】ａｎｔｉｇｅｎ　ｗａｓ　ｃｏａｔｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＮＣ）ｔｏ　ｍａｄｅ　ａｓ　ｔｅｓｔ　ｌｉｎｅ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｉｄｕｅ　ｄｒｕｇ　ｉｎ　ｓａｍｐｌｅ　ｗｏｕｌｄ　ｂｅ　ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｔｈｅ　ａｎｔｉ—ａｆｌａｔｏｘｉｎｓ　Ｂ１　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｄｒｕｇ　ｉｎ　ＮＣ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｗｏｕｌｄ　ｂｅ　ｓｈｏｗｅｄ　ｂｙ　ｃｏｌｏｒ　ｄｉｒｅｃｔｌｙ．Ｗｈｅｎ　ｔｅｓｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｅｄｉｂｌｅ　ｏｉｌ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ｔｈｅ　ｌｏｗｅｓｔ　ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ　ｌｉｍｉｔ　ｒｅａｃｈｅｓ　０．５　ｇ／Ｌ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｔｅｓｔ　ｃａｎ　ｂｅ　ｃｏｍｐｌｅｔｅｄ　ｉｎ　ｌｅｓｓ　ｔｈａｎ　２０　ｍｉｎ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｓｈｏｗｓ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｔｅｓｔ　ｄｅｖｉｃｅ　ｉｓ　ｈｉｇｈ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｓｐｅｃｉｉｆｃ　ａｎｄ　ｉｓ　ｅａｓｙ　ｔｏ　ｏｐｅｒａｔｅ．Ｉｔ　ｃａｎ　ｂｅ　ａｎ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｔｏ　ａｓｓｉｓｔ　ｔｈｅ　ａｆｌａｔｏｘｉｎｓ　Ｂ１　ｏｎ—ｓｉｔｅ　ｓｕｐｅｒｖｉｓｉｏｎ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　ａｆｌａｔｏｘｉｎｓ，ｈａｐｔｅｎ，ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ｇｏｌｄ　ｃｏｌｌｏｉｄ，ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ