氧氟沙星ELISA检测方法的建立

中圄桀科夫擎学报ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ２００７，３８（３）：２３３—２３５２３３氧氟沙星ＥＬＩＳＡ检测方法的建立孙武勇１，屈凌波２’３３，王云龙４，刘文英１（１中国药科大学药物分析教研室，南京２１０００９；２郑州大学化学系，郑州４５００５２；３安阳师范学院，安阳４５５００２；４河南省生物工程技术研究中心，郑州４５０００２）摘要目的：建立氧氟沙星（ＯＦＬ）的ＥＬＩＳＡ快逮检测方法。方法：在制备抗ＯＦＬ单克隆抗体基础上，采用间接竞争酶联免疫吸附方法（ｃｉＥｕｓＡ）检测ＯＦＬ的含量。结果：筛选得到特异性分泌抗ＯＦＬ的单克隆抗体细胞株３ｑ和３Ｄ９，应用３Ｇ３所制备腹水建立的ｃｉＥＬＩＳＡ工作曲线的线性范围为０．５～１２８ｎｇ／ｍＬ（ｒ２＝０．９８５８），最低检出浓度为０．５ｎｇ／，，，Ｌ，半数抑制浓度Ｉｃ。为７．０ｎｇ／ｌｎＬ，样品加样回收率为８４％～１２０％，批内变异系数和批问变异系数均小于１５％。结论：本文建立的氧氟沙星ＥＨＳＡ检测法可满足０ＦＬ残留检测的需要。关键词氧氟沙星；单克隆抗体；酶联免疫吸附法Ｒ９１７中图分类号文献标识码Ａ文章编号１０００—５０４８（２００７）０３—０２３３—０３ＥｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆＥＬ｜ＳＡｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｆｏｒｏｆｌｏｘａｃｉｎＳＵＮＷｕ—ｙｏｎ９１，ＱｕＬｉｎｇ—ｂ０２，３，ＷＡＮＧｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＡｎａｌｙｓｉｓ，ＣｈｉｎａＹｕｎ—ｌｏｎ９４，ＬＩＵＷｅｎ—ｙｉｎ９１Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ７ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１０００９；２却酬，，跏￡ｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＺｈｅｎｇｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ４５００５２；３ＡｎｙａｎｇＴｅａｃｈｅｒｓＣｏｌｌｅｇｅ，Ａｎｙａｎｇ４５５００２；４ＨｅｎａｎＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＲｅｓｅａｒｃｈ．Ｃｅｎｔｅｒ，ＺｈｅｎＮｚｈｏｕ４５００３２，ＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔＡｉｍ：ＴｏｄｅｖｅｌｏｐＥＨＳＡｆｏｒｔｈｅａｓｓａｙｏｆｏｆｌｏｘａｃｉｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＯｆｌｏｘａｃｉｎＷａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｉｎｄｉｒｅｅｔｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅ．１ｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ（ｃｉＥＨＳＡ）ＯＨｔｈｅｂａｓｉｓｏｆｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙａｇａｉｎｓｔｗｅｒｅｏｆｌｏｘａｃｉｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｗｏｈｙｂｒｉｄｏｍａｌｉｎｅｓ３Ｇ３ａｎｄ３Ｄ９ｌｉｎｅａｒｒａｎｇｅｏｆ０．５～１２８Ｗａｓ７．０ａｓｓａｙｉｓｏｌａｔｅｄ．ＴｈｅｌｉｎｅａｒｒａｎｇｅｏｆｔｈｅｃｉＥＬＩＳＡｕｓｉｎｇ３Ｇｈａｄａｎｇ／ｍＬ（ｒ２＝０．９８５８）．Ｔｈｅｌｏｗｏｆｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＬｏＤ）ｏｆｔｈｅａｓｓａｙｗａｓ０．５ｒｉｇ／ｍＬ，ａｎｄＩＱｏｎｇ／ｍＬ．ＴｈｅａｎｄｒｅｃｏｖｅｒｙｏｆｏｆｌｏｘａｃｉｎｓｐｉｋｅｄｉｎｓａｍｐｌｅｓＷａｓａｍｏｎｇ８４％～１２０％．Ｂｏｔｈｔｈｅｉｎｔｅｒ－ａｓｓａｙａｎｄｉｎｔｒａ—ｒａｐｉｄ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｎｄｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｏｆｖａｒｉａｔｉｏｎ（ＣＶ）ＷａｓｌｅＳＳｔｈａｎ１５％．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＴｈｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｍｅｔｈｏｄｉＳｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｃｏｕｌｄｍｅｅｔｔｈｅｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓｉｎｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｏｆｌｏｘａｃｉｎｒｅｓｉｄｕｅ．ｏｆｌｏｘａｃｉｎ；ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌＫｅｙｗｏｒｄｓＴｈｉｓｓｔｕｄｙｗａｓａｎｔｉｂｏｄｙ；ＥＨＳＡＰｒｏｖｉｎｃｅ（Ｎｏ．０４２１００２３００）ｓｕｐｐｏｓｅｄｂｙｔｈｅＩｎｎｏｖａｔｉＯｎＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒＥｘｃｅＨｅｎｔＳｃｈｏｌａｒｓｏｆＨｅｎａｎ氧氟沙星（ｏｆｌｏｘａｃｉｎ，ＯＦＬ）属于氟喹诺酮类抗菌药物，作为临床用药和兽药应用较为广泛，其残留可能引起的耐药性等问题已引起学者极大关注。目前报道的ＯＦＬ的分析方法有高效液相色谱法…１、荧光光谱法１２－和毛细管电泳法∞ｊ等，上述方样品前处理简单，并可同时检测大量样品。１材料１．１试剂和仪器氧氟沙星对照品（ＯＦＬ，河南省药品检验所）；法仪器昂贵且操作繁琐。目前ＥＬＩＳＡ快速检测方法在小分子化学品物质残留的检测方面得到了广牛血清白蛋白（ＢＳＡ）、卵清白蛋白（ＯＶＡ）、弗氏佐剂和四甲基联苯胺（ＴＭＢ）（美国Ｓｉｇｍａ公司）；胎牛血清（美国Ｇｉｂｃｏ公司）；ＰＥＧ２０００（美国Ｍｅｒｃｋ公司）；ＨＲＰ标记羊抗鼠ＩｇＧ二抗（河南华美生物工程）；９６泛的应用１４－６ｊ。本文以抗ＯＦＬ单克隆抗体为基础，建立ＥＨＳＡ检测方法，该法灵敏、快速、特异性好、收稿日期２００６．１２．２５基金项目４通讯作者Ｔｅｌ：０３７１～６７７６３９５２Ｅ－ｍａｉｌ：ｑｕｌｉｎｇｂｏ＠ＺＺＵ．ｅｄｕ．Ｏｉｌ河南省杰出人才创新基金资助项目（Ｎｏ．０４２１００２３００）万方数据　中圃蒜秆天擎学报ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ第３８卷孔细胞培养板和２４孑Ｌ细胞培养板（丹麦ＮＵＮＣ公司）；ＢＡＬＢ／ｃ小鼠（河南省实验动物中心）；ＳＰ２／０骨髓瘤细胞（河南省生物工程技术中心）；ＷｅｌｉｓｃａｎＭＫ３酶标仪（芬兰Ｔｈｅｎｎｏ公司）。２方法２．１完全抗原的合成ＯＦＬ是不具备免疫原性的小分子半抗原，利用其３位上的羧基同载体蛋白中的氨基反应，以碳二亚胺法合成氧氟沙星．牛血清白蛋白（ＯＦＬ—ＢＳＡ）作为完全抗原用于小鼠免疫；以混合酸酐法合成氧氟沙星一卵清蛋白（ＯＦＬ．ＯＶＡ）作为包被抗原用于ＥＬＩＳＡ检测例。２．２免疫小鼠以ＯＦＬ．ＢＳＡ免疫８周龄雌性ＢＡＬＢ／ｃ小鼠３只，采用腹腔注射，以ＢＳＡ量记每只１００嘏。首次免疫以弗氏完全佐剂乳化，之后每次间隔２周用弗氏不完全佐剂乳化相同量抗原加强免疫。每次免疫１周后，尾静脉采血分离血清，用间接ＥＬＩＳＡ法检测。效价高于１：１００００后取效价最高小鼠的脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞进行融合。融合前３ｄ不加佐剂直接用抗原免疫１００ｔｔｇ。２．３细胞融合处死小鼠，取脾脏分离脾细胞，使其与处于对数生长期的ＳＰ２／Ｏ骨髓瘤细胞在５０％ＰＥＧ２０００作用下按５：１融合。将融合后的细胞悬液加入提前１ｄ制备的有饲养细胞的９６孔细胞培养板上，５％ｃ０２培养箱中以ＨＡＴ培养基选择培养，１周后逐步过渡到ＨＴ培养基。２．４阳性杂交瘤细胞筛选及克隆化融合１周后，采用问接．ＥＬＩＳＡ进行筛选。以每孑ＬＯＦＬ—ＯＶＡ４０ｎｇ包被９６孔酶标板，洗板后用ｌ％酪蛋白封闭２ｈ。细胞融合板中取各孔上清１００ｔＬＬ分别对应加入酶标板于３７℃温育０．５ｈ，洗板后再加入辣根过氧化物酶标记羊抗鼠ＩｇＧ（１：２０００）１００皿３７℃温育０．５ｈ，洗板后ＴＭＢ显色，２ｍｏｌ／ＬＨ２Ｓ０４终止反应，测定Ａ４５０，以６３０ｎｍ作参比。选择Ａ。∞大于１的孔，再用间接竞争酶联免疫法（ｃｉＥＵＳＡ）继续筛选，在加人抗体步骤的同时，加入１００ｎｇ／ｍＬＯＦＬ标准溶液，其余步骤同间接．ＥＬＩＳＡ法。吸收度有明显降低的孔，则存在竞争抑制。挑出有抑制效应的孔，采用有限稀释法连续克隆化直万　方数据至１００％阳性，扩大培养后液氮冻存。２．５单克隆抗体腹水的制备与鉴定取３月龄雌性ＢＡＬＢ／ｃ小鼠腹腔注射液体石蜡（每只０．５ｍＥ），１周后每只腹腔注射１×１０６个杂交瘤细胞，濒死时采集腹水。采用饱和硫酸铵一辛酸法纯化腹水，测定蛋白含量及ＥＵＳＡ效价。单克隆抗体的纯度及相对分子质量测定采用ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳法检测。分别采用ＢＳＡ、ＯＶＡ和两种合成抗原ＯＦＬ．ＢＳＡ、ＯＦＬ．ＯＶＡ包被酶标板后检测腹水，鉴定抗体的特异性。２，６ＯＦＬ单克隆抗体ＥＬＩＳＡ工作曲线应用制备得到的单克隆抗体建立ＯＦＬ的ｃｉＥＬＩＳＡ法。在加一抗步骤中，每孔加人工作效价的单克隆抗体５０止，同时加入样品稀释液配制的系列浓度的ＯＦＬ标准溶液５０皿。参照文献［８］，考察竞争抑制工作曲线（以加入ＯＦＬ的吸收度Ａ与不含ＯＦＬ的吸收度Ａｏ的比值Ａ／Ａｏ为Ｙ轴，ＯＦＬ浓度的对数值为ｘ轴）、最低检出限以及半数抑制量ＩＣｓｏ。２．７单克隆抗体的交叉反应性选取氟喹喏酮类的左氧氟沙星、环丙沙星、洛美沙星和其他几种常用抗菌药物（氯霉素、红霉素、四环素、阿莫西林），同上法分别加入各系列浓度的药物得到抑制曲线，以ＯＦＬ的Ｉｃ５０与竞争物的Ｉｃ５０之比来计算交叉反应率。２．８样品的测定及回收率尿液样品离心去杂物后，可直接用于检测。牛奶样品采用样品稀释液稀释１０倍后用于检测。血样经自然分离得到血清后，用样品稀释液稀释１／１０用于检测。取同一批次空白尿样、牛奶和血清分别加入１．０，ｉ０．０，１００ｎｇ／ｍＬＯＦＬ，各重复５次，计算回收率及批内变异系数。另外取空白尿样分别在３个不同时间批次作ＯＦＬ加样量为１０．０ｎｇ／ｍＬ的回收率实验，计算批间变异系数。３结果３．１ＯＦＬ单克隆抗体腹水鉴定经测定脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞的融合率为８７％，经间接一ＥＬＩＳＡ初筛后阳性率为２０％，再用ｃｉＥＬＩＳＡ筛选并经过３次单克隆后最终得到２株传代分泌稳定、阳性值高且特异性好的杂交瘤细胞，分别命名为３Ｇ３和３Ｄ９。腹水纯化后３Ｇ３和３Ｄ９单克隆抗体蛋白含量分别为３．１ｒａｇ／ｍＥ和２．７ｍｇ／ｍＬ。第３期孙武勇等：氧氟沙星ＥＬＩＳＡ检测方法的建立ＳＤＳ．Ｐ１ＡＧＥ电泳结果显示纯度约为９０％，相对分子质量约１６０ｋＤ，两株单克隆抗体腹水的ＥｕＳＡ结果基本相同，终点效价可达１：５００００００，吸收度在１．５左右的工作效价为１：１０００００。结合所测定蛋白浓度及相对分子质量计算得到亲和力常数为５．１６Ｘ１０９ｍｏｌ／Ｌ。腹水单克隆抗体只与ＯＦＬ—ＢＳＡ、ＯＦＬ—ＯＶＡ两种包被抗原产生反应而与ＢＳＡ、ＯＶＡ均无反应，说明腹水中抗体具有特异性。３．２ＯＦＬ的ｃｉＥＬＩＳＡ工作曲线应用ＯＦＬ单克隆抗体３Ｇ３建立的ｃｉＥＬＩＳＡ法在０．５～１２８ｎｇ／ｍＬ之间线性关系良好。工作曲线为Ｙ＝一０．４７０９Ｘ＋０．８９７３，ｒ２＝０．９８５８，半数抑制浓度ＩＣ５０为７．０ｎｇ／ｍＬ，最低检测限为０．５ｎ＃ｍＬ。３．３ＯＦＬ单克隆抗体的交叉反应性单克隆抗体３Ｇ３与ＯＦＬ的左旋体左氧氟沙星的交叉反应率为９２％，与另两种常见的氟喹喏酮类药物环丙沙星、洛美沙星均小于ｌ％，与其他种类常用抗生素可认为无交叉反应（见表１）。结果表明该单克隆抗体对于检测ＯＦＬ有很好的特异性。Ｔａｂ．１Ｃｒｏｓｓ—ｒｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｍｏｎｏｃｔｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙａｇａｉｎｓｔｏｆｌｏｘａｃｉｎｅ３．４回收率测定及批内变异系数针对空白尿样的３个不同批次所做１０．０ｎｇ／ｍＬ加样回收率分别为８６％，１０４％和９１％，平均回收率为９３％，批间变异系数为１０．０％。同一批次尿样、牛奶样品及血清样品的加样回收率结果见表２。Ｔａｂ．２Ｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｅｒｅｃｏｖｅｒｙｔｅｓｔｓ（ｘ±ｓ．ｎ＝５）万　方数据４讨论与液相色谱法等相比，本文建立的方法样品前处理简单，灵敏度高，可在２ｈ内得到结果，并可利用多孑Ｌ酶标板同时测定上百个样品，非常适合于基层现场快速检测的需求。回收率试验中当加样量为１．０ｎｇ／，叫Ｌ时测定３种实际样品的ＲＳＤ均较大（平均值达１２％），回收率最高达１２０％，当添加量为１０．０ｎｇ／ｍＬ时回收率在８８％～１０５％，ＲＳＤ相比也均较小（平均值为４．７％）。可能是由于加样量１．０ｎｇ／ｍＬ接近方法的最低检测限０．５ｎｇ／ｍＬ所造成的，此时系统误差较大。而加样量１０．０ｎｇ／ｍＬ接近于工作曲线的半数抑制浓度ＩＣ５０（７．０ｎｇ／ｍＬ），因此检测精度大大提高。本检测方法批内变异系数和批间变异系数均小于１５％，达到农业部对于兽药残留ＥＬＩＳＡ试剂盒的技术指标要求，同时也达到ＯＦＬ残留限量规定较为严格的日本标准（１０ｎｇ／ｍＬ）的检测要求。采用本文建立的方法可以提供大量稳定连续的且效果均一的ＥＬＩＳＡ检测试剂盒产品。参考文献１１ＪＨｅｍａｎｄｅｚ—ＡｒｔｅｓｅｒｏｓＪＡ，ＢａｒｂｏｓａＪ，ＣｏｍｐａｎｏＲ．Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｑｕｉｎｏｌｏｎｅｒｅｓｉｄｕｅｓｉｎｅｄｉｂｌｅａｎｉｍａｌｐｒｏｄｕｃｔｓ［Ｊｊ．ＪＣｈｒｏｍａｔｏｇｒＡ，２００２，９４５（１）：１—２４．［２］杜黎明（ＤｕＬＭ），吴吴（ｗｕＨ）．左旋氧氟沙星的荧光光谱研究［Ｊ］．分析科学学报（ＪＡｎａｌＳｃｉ），２００５，２１（６）：６０３—６０７．［３］林伟风（ＬｉｎＷＦ），唐信煌（ＴａｎｇＸＨ），陈缵光（ＣｈｅｎＺＧ）．毛细管电泳法测定氧氟沙星及左氧氟沙星在其制剂中的含量［Ｊ］．中国抗生素杂志（ＣｈｉｎＪＡｎｔｉｂｉｏｔ），２００５，３０（１２）：７５６—７５９．［４］周洪斌（ＺｈｏｕＨＢ），徐文久（ＸｕＷＪ），朱金连（ＺｈｕＪＬ），等．进出口植物产品中甲霜灵残留量酶联免疫检测试剂盒的研究［Ｊ］．免疫学杂志（１ｒｒｍ．ｍｏｌＪ），２００５，２１（３）：１３８—１４１．［５］赵丕成（ＺｈａｏＰＣ），袁大为（ＹｕｍｌＤＷ），祝润（ＺｈｕＲ），等．抗磺胺嘧啶单克隆抗体的制备及其ＥＩＪＳＡ检测试剂盒的建立［Ｊ］．细胞与分子免疫学杂志（ＪＣｅｌｌＭｏｌｌｎｍｍｎ０１），２００４，２０（２）：１９１—１９４．［６］安全（ＡｎＱ），李校望（ＬｉＸＫ），赵文（ＺｈａｏＷ），等．碱性成纤维细胞生长因子生物活性的ＥＬＩＳＡ检测［Ｊ］．中国药科大学学报（ＪＣｈｉｒｍＰｈａｒｍＵｎｉｖ），２００５，３６（５）：４５７—４６０．［７］邹明（ＺｏｕＭ），陈杖榴（ＣｈｅｎＺＬ）．二氟沙星人工抗原的合成与鉴定［Ｊ］．中兽医医药杂志（ＪＴｒａｄｉｔＣｈｉｎＶｅｔＭｅｄ），２００３，２２（６）：６—９．１８ＪＳｈｅｌｖｅｒＷＬ，ＳｍｉｔｈＤＪ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｎｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｆｏｒｔ１１ｅＢ，ａｄｒｅｎｅｒｇｉｅａｇｏｎｉｓｔｒａｅｔｏｐａｍｉｎｅ［ｊ］．ＪｌｍｍｕｒｕⅥｚｓａｙ，２０００，２１（１）：】一２３