生物制品 质量标准内容及结构确证内容

检定方法、质控标准

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理化性质：外瞧〔外形、颜色、气味〕、pH 均一性：纯度、浓度 鉴不 结构确证

效价：生物学活性、免疫学活性

剩余杂质：产品、工艺、环境相关的杂质 起草、制定?制造与检定规程? 研究建立国家标准品或参考品

重组蛋白质药物质量标准研究

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效价：生物学活性与比活性 蛋白质纯度 蛋白质含量

理化性质鉴定〔局部特不规〕 剩余杂质

平安性及其它工程

一生物学活性及比活性测定

(一)检测意义

猎取正确的效价信息，保证产品有效 效价：有效性指标，反映药品效力

生物学活性才能真实反映生物技术药效价

缘故：生物制品分子大、结构复杂、不稳定，使得重量与效价不一致 生物制品技术药：~单位〔U、AU、IU〕

〔二〕生物学活性测定方法分类

1、动物根底的活性测定

离体动物器官法：脑利钠肽的兔主动脉 体内测定法：EPO的小鼠网织红细胞 2、细胞根底的活性测定

 促细胞生长法：大多数细胞因子类

 抑制细胞生长法：细胞毒素、血管抑制剂  间接保卫细胞法：IFN保卫WISH 3、酶学根底的活性测定：重组酶类

4、受体-配体、抗原-抗体结合根底的活性测定： 抗原决定簇与活性中心常不一致

〔三〕生物学活性测定方法选择

1、细胞培养法＞离体器官法＞体内法

2、细胞染色标记方法：MTT＞3H-Thymidine＞流式细胞仪〔测细胞周期、凋亡〕 3、定量法＞半定量法＞定性法

4、生物学活性不一定与临床药效类型一致

工艺稳定、测生物活性特别复杂时，可替代。如rh-GH用HPLC

〔四〕生物学活性测定〔见药典附录ⅩC〕

1、样品：原液、成品

2、方法：如上述〔好好研究〕 3、标准：

不同生物活性测定方法的 标准

测定方 定标准

动物根底的活性测定70%-130%标示量 细胞根底的活性测定80%-120%标示量 酶学根底的活性测定85%-115%标示量 结合反响的活性测定85%-115%标示量

〔五〕蛋白质药物的比活性〔见分生实验册77页〕

1、样品：原液 2、定义与计算：

比活性：单位重量蛋白的活性单位数〔IU/mg) 3、标准：不小于。。。IU/mg 4、意义：

1〕真实反映有活性的蛋白质所占的比例 厂家间、表达系统间、批间比立 2〕便于配制成品

二蛋白质纯度检查

 样品：原液

 方法：必须采纳二种方法测定 非复原SDS-PAGE法 HPLC法

 标准：纯度均须到达95%或98%以上

非复原SDS-PAGE法测定纯度〔见药典附录ⅣC〕

 SDS-PAGE：据分子大小不离

 样品处理：样品不加β-ME或DTT

二硫键未翻开，反映单体、二聚体或多聚体情况

 染色方法与上样量 银染:5ug〔检测限为1-10ng〕

考马斯亮蓝R-250：10ug〔检测限为〕

 定量方法：凝胶扫描

 标准：无明显杂带，纯度≧95%或98% HPLC法测纯度〔见药典附录ⅢB〕

 分析柱：反相柱、离子柱、分子筛 应尽量采纳反相柱或离子柱 应注明采纳的分析柱性质

 上样量：5ug

 标准：出峰时刻正确纯度：≧95%或98%

三、蛋白质含量测定(见药典附录ⅥD)

 样品：原液、成品  方法：

*Folin-酚试剂法〔Lowry法〕：〔见分生实验册67-73页〕 简便、灵敏、优先采纳，灵敏度：5-100ug/ml *染色法〔Bradford法〕：

考马斯亮蓝G-250，简便灵敏，25-200ug/ml BCA(二喹啉甲酸)法：

操作简单，比Lowry法快4倍且更加方便，正确灵敏：20~200ug/ml，微量BCA的测定范围在0.5~10ug/ml。经济适用，抗试剂干扰能力比立强。 紫外分光广度法：

用于原液比活性计算和成品规格操纵

四、蛋白质药物理化性质鉴定

〔一〕特异性鉴不试验

1、样品：原液和成品 2、方法：免疫印迹法 WesternBlot、DotBlot 3、标准：应该阳性

〔二〕相对分子量测定

1、样品：原液

2、方法：复原型SDS-PAGE〔见分生实验册51页、见药典附录ⅣC〕、质谱法 3、标准：

1〕理论值±10%范围 2〕批与批间一致

〔三〕等电点测定〔见药典附录ⅣD〕

1、样品：原液 2、方法：

IEF：常规等电聚胶电泳〔见分生实验册55-57页〕 CE：毛细管电泳 3、标准： 1〕有明显主带 2〕理论值± 3〕批与批间一致

〔四〕紫外汲取光谱分析〔见药典附录ⅡA〕

1、样品：原液 2、方法：紫外扫描 3、标准：

1〕最大汲取波长与特征波长一致 2〕批与批间一致

〔五〕肽图分析〔特不规〕〔见药典附录ⅧE〕

1、样品：原液 2、方法：

溴化氰/胰蛋白酶裂解+HPLC/SDS-PAGE/CE/质谱法 3、标准：

1〕有特征性图谱 2〕批与批间一致

〔六〕氨基酸组成分析〔特不规〕

1、样品：原液 2、方法：

HCl/NaOH水解〔仅用于Trp测定〕 +氨基酸自动分析仪 3、标准：

1〕与理论值一致 2〕批与批间一致

〔七〕氨基酸序列分析〔特不规〕

1、样品：原液 2、方法：

N末端：15个残基，

Edman化学落解法，蛋白质全自动测序仪 C末端：1-3个残基

硫氰酸酯/羧肽酶落解法，RP-HPLC 3、标准：

1〕与理论值一致 2〕批与批间一致

〔八〕其它：二硫键、糖基化〔特不规〕

五、剩余杂质检测

〔一〕宿主相关杂质

宿主细胞蛋白含量：〔见药典附录ⅨC〕

1、样品：原液、成品 2、方法：

双抗体夹心ELISA：用HAS作保卫

宿主蛋白标准品：中检所提供 3、标准：

1〕大肠杆菌≤0.1% 2〕CHO≤0.05%

宿主细胞DNA含量〔见药典附录ⅨB〕

1、样品：原液、成品 2、方法：

DNA点印迹杂交法，地高辛标记 DNA标准品：厂家提供

3、标准：DNA含量≤10ng/剂量

细菌内毒素含量〔见药典附录ⅫE凝胶限量实验〕

1、样品：原液、成品 2、方法： 鲎试剂分析法

鲎试剂标准品：中检所提供 3、标准：

内毒素含量≤1０ＥＵ/剂量

〔二〕工艺相关杂质〔见药典附录ⅨA〕 如剩余抗生素、IgG、蛋白A、小牛血清 〔三〕产品相关杂质

如多聚体、不同的PEG修饰产物

六、平安性及其它检测工程

〔一〕无菌试验

平皿法，需氧菌、厌氧菌、真菌、支原体 〔二〕热原试验 鲎试剂法或家兔法 〔三〕异常毒性试验

小鼠〔1ml)或豚鼠〔5ml〕，腹腔注射 〔四〕水分、装量、pH值

原液质量标准

 生物学活性、比活性〔见药典附录ⅩC〕  蛋白质含量(见药典附录ⅥD)

 纯度：≧95%，非复原SDS-PAGE法〔见药典附录ⅣC〕、HPLC法〔见药典附录Ⅲ

B〕

 分子量：复原型SDS-PAGE法〔见药典附录ⅣC〕、质谱法  外源性DNA残留量：≤10ng/剂量〔见药典附录ⅨB〕  宿主蛋白残留量:≦0.1%，0.05%〔见药典附录ⅨC〕  剩余抗生素：不得检出〔见药典附录ⅨA〕

 细菌内毒素：≤10EU/剂量〔见药典附录ⅫE凝胶限量实验〕  结构确证：等电点〔见药典附录ⅣD〕、紫外汲取光谱扫描〔见药典附录ⅡA〕、N末

端15个氨基酸顺序、肽图〔见药典附录ⅧE〕、〔氨基酸组成、〕

成品质量标准

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鉴不试验：免疫印迹法/斑点法，阳性 物理检查：外瞧、可见异物、装量 化学检定：水分、pH值

生物学活性：标示量的%范围 无菌检查：不得检出

内毒素检查：≤10EU/剂量 异常毒性检查：符合