酵母蔗糖酶的分离提取
作者：XX 指导老师：XX
摘要：采用自溶法从酵母中提取蔗糖酶，即在一定PH和适当的温度下，利用组织细胞内自身的酶系统将细胞破碎
再通过乙醇的分级与透析，得到纯化的酵母蔗糖酶。本实验也通过考马斯亮蓝G250染色法，测定蔗糖酶的活力和蛋白质浓度，对蔗糖酶的性质进行了研究。最后的纯化倍数为2.8倍，所得产率为36.85%。
关键词：蔗糖酶，分离提取，酶活力，蛋白质含量
前言：蔗糖酶又称转化酶，可作用于β-1，2糖苷键，将蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖。蔗糖酶在工业上用以转化
蔗糖，增加甜味，制造人造蜂蜜，防止高浓度糖浆中的蔗糖析出，还用来制造含果糖和巧克力的软心糖等。蔗糖酶在畜牧方面，可防治禽兽的疾病，促进幼龄禽兽的发育，节约饲料和提高肉产量等；在农业方面可防治植物病害、刺激植物生长、提高作物产量；在工业上可用作鱼、肉、蔬菜和水果等食品的保鲜剂，同时也在植物的运输贮藏、碳水化合物代谢中发挥主要作用，并在渗透调节、抗逆性生长繁殖、以及信号传导方面也发挥着重要的作用。目前关于酵母中蔗糖酶提取纯化方面的研究较多，以甲苯自溶法最为常见。本实验采用自溶法从酵母中分离提纯蔗糖酶，通过测定得到的蔗糖酶的活力及蛋白质的含量。
1.材料与方法
1.1试剂
酵母粉（实验室提供）， 醋酸钠(0.5g)， 乙酸乙酯（8ml），10%醋酸，无水乙醇，1mol/LNaOH，蒸馏水，PH=4.7缓冲液，DNS试剂，0.9%NaCL，考马斯亮蓝G-250，系列标准蛋白液，150mol/L 磷酸等。 1.2器材
离心机，722分光光度计，水浴锅，量筒25ml，烧杯100ml，大小试管若干，各种专用移液管，吸耳球，玻离棒，胶头滴管，PH试纸等。 1.3操作方法
1．3.1蔗糖酶粗品制备方法 (1)自溶法
将5g酵母粉倒入500mL烧杯中、少量多次的加入15mL蒸馏水，搅拌均匀，成糊状后加入0.5g乙酸钠、8mL乙酸乙酯，搅匀，盖好，于35℃恒温水浴中搅拌30min。 (2)抽提
补加蒸馏水10mL，搅匀，盖好，于35℃恒温过夜，4000r/min 离心10min,弃沉淀，得E1;量体积V1=17.5mL,取出2mL置于4℃冰箱保存，待测酶活力及蛋白质浓度(留样1)。 （3）乙醇分级和透析
测E1 pH：用10%HAC调pH至4.5（注意少量、慢加、搅匀，防止调过），共加入0.5ml 10%HAc; （a）第一次乙醇分级（30%乙醇饱和度）：计算出使Ｅ１得乙醇浓度达30%时所需的无水乙醇X1的体积为6.6ml，将Ｅ１和乙醇Ｘ１，放入冰浴中预冷，在不断搅拌下缓慢滴加乙醇，4000ｒ／min离心10min，弃沉淀，留上清，得E2；量体积V2=19.5ml（留样２）;
(b)第二次乙醇分级（50%乙醇饱和度）同上法加入X2（为达50%乙醇饱和度时需要补加的无水乙醇的体积），计算的加入无水乙醇X2为7.0mL。4000ｒ／min离心10min，弃上清，沉淀立即用10ml 150mol／L pH6.0的磷酸溶解，并装入透析袋，透析６小时，之后，4000ｒ／min离心10min，得E3，量体积V3＝11.0mL（留样３）;
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1.3.2蛋白质浓度测定——考马斯亮蓝G250染色法 (1)蛋白质标准曲线的制作
表1 蛋白质定量测定标准曲线制作
溶液 0管 1管 2管 3管 4管 5管 留样1 留样1’ 系列标准溶液蛋白/mL -- 0.2 0.4 0.5 0.8 1.0 1 1 实际蛋白质含量/ug -- 20 40 60 80 100 -- -- 0.9%生理盐水/mL 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 -- -- -- 蛋白质染液/mL 2.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
轻轻摇匀，5min后以0号管调空白，595nm分光光度法测光密度值，汇出标准曲线。未知样品从标准曲线上查出相应浓度 经测定，得
表2 蛋白质含量与光密度值测定结果
试管号 0
1
2 40
3 60
4 80
5 100
实际蛋白质含量（mg) 0 20
OD595 0 0.186 0.286 0.417 0.501 0.677
OD值/595nm图1 蛋白质定量测定标准曲线0.80.70.60.50.40.30.20.1000.020.040.060.080.1y = 6.7255xR2 = 0.98430.12蛋白质含量/mg
根据得到的蛋白质曲线得到公式：y=6.7255x （x表示蛋白质含量，y表示OD595值） (2)蛋白质浓度测定
从留样中取0.3ml加0.9%的Nacl 稀释至3ml,再按以下表格操作测定
表3 蛋白质浓度OD值
溶液 对照组 留样 系列标准蛋白液/ml — 0.5 0.9%生理盐水/ml 1.0 0.5 蛋白质染色液/ml 5.0 5.0
1.3.3葡萄糖浓度标准曲线
葡萄糖曲线公式：y=0.0746x+0.0024（x表示葡糖糖含量单位mg，y表示A520值） 1.3.4测蔗糖酶活性方法
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取5%的蔗糖、酶液5ml分别于35℃水浴中预热5min[若酶浓度过高，用0.02mol/L的醋酸缓冲液（pH=4.7）适当稀释］。
表4 蔗糖酶水解蔗糖
试管 0 1 5％蔗糖(mL) 2 2 1mol/ml NaOH(mL) 0.5 - 酶液(mL) 2
2
35℃水浴，3min
1mol/ml NaOH(mL) - 0.5
表5 还原糖的测定
试管 0 1
2
反应液(mL)
0.5 0.5 0.5
（取自表1中0管） （取自表1中1管） （取自表1中1管）
DNS试剂(mL) 3 3 3 水(mL) 1.5 1.5 1.5
沸水浴5min后，立即流水冷却
水(mL) 20 20 20
OD520
在葡萄糖标准曲线上找到所测定光吸收值对应的葡萄糖含量，按下面公式计算酶活力： 蔗糖酶活力单位＝葡糖糖毫克数×９×酶的稀释倍数
在本实验条件下，每３ｍｉｎ释放１毫克还原糖所需的酶量，定义为一个活力单位。
2.结果与分析
2.1结果 经测量和计算得
表6 蛋白质浓度
OD595
项目
E1 E2 E3
1 0.842 0.554 0.181 2 0.939 0.526 0.190 平均 0.1 0.540 0.186 蛋白质含量（mg） 23.1 15.7 3.04
表7 酶活力测定
OD520
项目
E1(稀释15倍) E2(稀释10倍) E3(稀释10倍)
1 0.861 0.586 0.761
2 0.911 0.538 0.797 平均值 0.886 0.562 0.779 葡萄糖毫克数/mg 11.84 7.501 10.41 蔗糖酶活力单位 （u） 799.2 337.5 468.5
由表6可知留样的蛋白质含量依次降低。而有表7可知留样的蔗糖酶活力单位是E1>E3>E2。
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表8 蔗糖酶分离提取效果计算结果
留 体积 蛋白质浓度 总蛋白 活力 总活力 比活力 纯化 产量 样 ml (mg/ml) (mg) （U/ml） （U） (U/mg) 倍数 （回收率） 1 17.5 1.32 23.1 7992 139860 60545 1 1 2 19.5 0.803 15.7 3375 65813 4192 0.692 47.06% 3 11.0 0.276 3.04 4685 51535 16952 2.80 36.85%
2.2分析
（1）在测OD值时，电子示数不稳定，可能是由于溶液内部的物质分布不均匀，因而计算所得的蛋白质浓度和酶活结果时与理论会有偏差。
（2）实验中由于无法预先知道所提取的蔗糖酶的活力，所以对三个留样的稀释倍数有个检验的过程,最终结果见表7.若稀释倍数过低，0号管所加的NaOH无法钝化酶活,不能作为对照组来校准系数，OD值无法测得；若稀释倍数过高，测得OD值过小（小于0.1），结果不理想，OD值在0.1～0.9效果比较好。
（3）实验中，在蛋白质浓度测定时所用稀释倍数均为300倍，留样的蛋白质含量依次降低，即非酵母蔗糖酶的蛋白质逐步被分离出去。
（4）从比活力的测定看，留样2的比活力比留样1小，极大可能是由于在用10%HAC调E1的PH至4.5过程中加入过多的平衡液，同时也反映在留样2的纯化倍数小于留样1（按照理论，纯化的倍数应越来越高，即[E1]<[E2]<[E3]）。 3．讨论
(1)自溶法细胞破碎过程中，酵母粉的搅拌均匀程度将影响整个实验的操作及结果。
(2)自溶法分离提取酵母蔗糖酶的操作过程简单，便于掌握，但实验过程太长，细胞易受到污染，因而在测定蛋白质浓度时，会产生较大误差并且不适合大规模工业生产。目前蔗糖酶的分离提取的方法较多，如甲苯自溶法、冻融法、SDS抽提法。其中甲苯自溶法所用试剂简单、价格低廉，但由于其耗时长、重复性差、酶活性低等缺陷，提取效率远低于冻融法和SDS抽提法。从提取效率来看，SDS抽提法最高，还具有操作简便易行、生产成本低、同收率高等特点，更适合酵母蔗糖酶的工业化大规模生产。本实验还可以接着经质量分数50％的乙醇分级沉淀后再尽享Mono Q阴离子交换柱层析纯化，制得高纯度的酵母蔗糖酶。还可更近一步纯化的酶进行等电聚焦测定等电点，鉴定其相对分子质量，以蔗糖为底物剥得酵母蔗糖酶的表观米氏常数，深入全面研究蔗糖酶。
4.结论
本实验采用自溶法从酵母中提取蔗糖酶，通过乙醇的分级与透析，得到纯化的酵母蔗糖酶。纯化倍数为2.80倍，提取产品的酶总活力为5153.5，比活力为1695.2，蛋白质浓度为0.276，回收率为36.85%.
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The Separation and Extraction of Yeast Invertase
Abstract: This paper used Autolysis method to separate and extract invertase from yeast. That is, in a certain pH and the proper temperature, the use of organization cells own enzyme system will be broken again through the cell ethanol classification and dialysis, get the purified yeast invertase. The experiment alsomeasure and calculate the enzyme activity of Yeast Invertase and protein concentration to study the nature of the invertase through Coomassie brilliant blue G250 staining method. At last the purification multiples is 2.8 times, the yield is 36.85%.
Key words: yeast invertase、sparation and extraction、enzyme activity、protein concentration
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