分子标记辅助选择复习资料(GAU)

第一章

1.DNA变性：在高温或某些化学试剂作用下双链DNA分子的两条互补的单链会相互分开的过程。

2.DNA复性：当变性的外界条件消除后，互补的单链DNA又可恢复双螺旋结构的过程。

3.基因组：是指一种生物或个体细胞所具有的一套完整的基因及其序列。 4.显性标记：是指F1的多态性片段与其亲本之一完全相同。如RAPD, AFLP等。 5.共显性标记：是指双亲的两个以上分子量不同的多态性片段均在F1中表现，如RFLP, SSR,SCAR, ISSR, CAPs。

6.琼脂糖凝胶电泳：分离，纯化和鉴定长度为0.2—50Kb的DNA片段。应用于RAPD,RFLP,ISSR,SCAR等。 7.聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：分离，纯化和鉴定长度为5—500bp的DNA长度。

非变性PAGE:应用于SSR等 变性PAGE:应用于AFLP等 8.纯化后DNA浓度的确定： OD260∕OD280=1.8 纯DNA OD260∕OD280<1.8 有蛋白污染 OD260∕OD280>1.8 有RNA污染 OD260∕OD280=2.0 纯RNA

OD260∕OD280<2.0 有盐，多糖等污染 9.理想分子标记需达到的要求： ①具有高的多态性

②共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和純合基因性 ③能明确辨别等位基因

④除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组 ⑤选择中性（即无基因多态性） ⑥检测手段简单，快速

⑦开发成本和使用成本尽量低廉 ⑧在实验室内和实验室间重复性好 10.分子标记优越性

①直接以DNA的形式表现

②数量多，遍及整个基因组，检测位点近于无限 ③多态性高，不需要专门创造特殊的遗传材料

④不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁 ⑤有许多分子标记表现为共显性 11.分子标记类型

1）以分子杂交为基础的DNA标记技术 ①性片段长度多态性（RFLP） ②可变数目串联重复序序列（VNTR） ③染色体原位杂交（In situ Hybridization）

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2）以PCR为基础的DNA标记技术 ①随机扩增多态性DNA（RAPD） ②简单重复序列间区DNA（ISSR） ③简单重复序列DNA（SSR） ④扩增片段长度多态性（AFLP） ⑤序列标签座位（STS）

⑥序列特征化扩增区域（SCAR） 3）其他

①SNP（单核苷酸多态性） ②EST（表达序列标签）

③Retro-transproson（反转录转座子） 12.DNA提取流程

样品研磨（充分）——加提取液提取——沉淀DNA（离心）——TE溶解——RNase A去RNA——酚/氯仿去蛋白——沉淀DNA，并溶于TE

第二章

1. PCR反应的基本过程

1）变性：模版DNA经过加热至94℃左右，使模版DNA双链解开成为单链，以便它与引物结合 2）退火：模版DNA经加热变性成单链后，温度将至55℃左右，引物与模版DNA单链的互补序列配对结合成局部双链

3）延伸：模版DNA--引物结合物在Taq聚合酶的翠催化作用下，以dNTP为反应原料，按碱基互补配对与半保留复制原理，引物5′→3′方向延伸，最终合成一条新的与模版DNA链互补的DNA双链。 2.PCR反应的动力学 ①DNA扩增呈2n上升

②Y=(1+X)n计算（Y=100时，呈2n增长） Y---DNA片段扩增后的拷贝数 X---平均每次的扩增效率 n---循环次数

③PCR反应的平台期效应：反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称为平台期效应。 3.PCR反应五要素：①引物②Taq酶③dNTP④模版DNA⑤Mg2+ 4.PCR引物设计的基本原则

①引物长度：15-30bp,常用20bp左右。

②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特殊条件下可扩增长至10kb的片段。 ③GC含量以40-60为宜，GC太少扩增效果不佳，GC过多易出现非特异条带。 ④ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ⑤避免引物内部出现二级结构，以及避免两条引物间互补，特别是3′端的互补。 ⑥避免 3′端的碱基，特别是最末和倒数第二个碱基，应严格要求配对。 ⑦引物中有或能加上合适的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。 ⑧应与核酸序列数据库的其他序列无明显同源性。

5.PCR的优点：①特异性强②灵敏度高③简便，快速④对样本DNA的纯度要求

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低

6.PCR过程中常出现的问题 1）假阴性：不出现扩增条带

原因：①模版不纯，含有蛋白、Taq酶抑制剂，或模版核酸变性不彻底②酶失活或活性不强③引物质量、浓度，两条引物的浓度是否对称是PCR失败的常见问题

2）假阳性：出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，

亮度更高。

原因：①引物设计不合适②靶序列或扩增产物的交叉污染

3）出现非特异性扩增条带：PCR后出现的条带与预计的大小不一致，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。 原因：①引物与靶序列不完全互补，或引物聚合形成二聚体②Mg2+离子浓度过高，退货温度过低，及PCR循环次数过多③酶的质量

4）出现smear现象：PCR扩增呈现涂抹带或片状带或地毯样带。

原因：①Taq酶量过多或酶的质量差。②dNTP浓度过高③Mg2+离子浓度过高④退货温度过低⑤循环次数过多

7.间并引物：实际上是由可能扩增出一个特定氨基酸序列编码区的多种引物组成

的混合物，这些引物之间的大部分序列是相同的。

8.间并引物的设计原则

1）选择保守性强且间并性低的氨基酸区域.

2）根据生物使用密码子的偏爱性，选择使用率最高的密码子，进一步限定引物

的间并性。

3）引物的3′端不应该存在间并，因为单碱基错配会阻碍延伸。

4）在一些多义位置使用可与多种碱基配对的脱氧次黄苷等稀有碱基以降低引物的间并度。

9.酶的类型：TaqDNApolymercase具有5’—3’的外切酶活性，而PfuDNApolymercase和VentDNApolymercase不具有5’—3’的外切酶活性。 10.PCR扩增产物回收为白色斑点

第三章

1.RFLP标记原理

1）性内切酶酶切后；2）电泳分离DNA片段；3）转移至纤维素薄膜；4）与放射性探针Southern杂交；5）放射性自显影或酶学检测分析阳性条带 2.RFLP的特点

1）无表型效应。2）RFLP具有种族特异性。3）RFLP标记具有共显性的特点。4）RFLP标记范围遍及全基因组。 3.VNTR基本原理

1）性内切酶的酶切位点必须不在重复序列中，以保证小卫星或微卫星序列的完整性。2）内切酶在基因组的其他部位有较多酶切位点。3）分子杂交所用DNA探针核苷酸序列必须是小卫星序列或微卫星序列。 4.CAPs的特点

1）引物与酶组合非常多，增加了揭示多态性的机会。2）在真核生物中，CARs标记呈共显性。3）所需DNA量极少，结果稳定可靠，操作简便，快捷。 5.RAPD的原理

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在RAPD反应过程中，由于短的随机单引物和低的退火温度作用，一方面保证了核苷酸引物与模板的稳定配对，另一方面因引物中碱基的随机排列而又允许适当的错配，从而扩大引物在基因组DNA中配对的随机性，提高了基因组DNA分析的效率。

6.RAPD与经典PCR反应的区别

1）引物：经典PCR反应所用的是一对引物，长度约为20bp，RAPD所用的为单引物，长度仅10bp。

2）反应条件：经典的PCR退火温度较高，一般为55℃--60℃，而RAPD的复性温度仅为36℃左右。

3）扩增产物：经典PCR的产物为特异扩增，而RAPD的产物为随机扩增。 7.RAPD的特点

1）为显性遗传，极少数表现为共显性遗传。2）RAPD引物一般为10bp长，人工合成成本低，技术简单。3）再现性差。 8.RAPD的PCR扩增条件

94℃预变形2分钟 94 ℃ 1分钟

36℃ 1分钟 30---40个循环 72℃ 1分钟 72℃延伸10分钟 4℃保存

9.SCAR标记（特定序列扩增）

SCAR标记是一种将RAPD标记转化成特异序列扩增区域标记(SCAR)的新方法。是共显性遗传。

10.AFLP引物由3部分组成

1）核心序列（core sequence, CORE）

2）性内切酶识别序列（enzyme-specific, ENZ） 3）选择性核苷酸序列（selective extension, EXT） 11.SSR标记的原理

两端序列多是保守的单拷贝序列，可以根据两端序列设计一对特异引物，通过PCR将其间微卫星序列扩增出来，利用电泳技术获得长度多态性。12.SSR的特点

1）数量几乎无限，检测出多态性的频率极高。2）SSR技术一般检测到的是一个单一的多等位基因位点。3）共显性标记。4）结果重复性高，稳定可靠。5）兼具PCR反应的优点。 13.ISSR的原理

1）利用真核生物基因组中广泛存在的SSR序列，设计引物，对两个相距较近，方向相向的SSR序列之间的DNA区段进行扩增。

2）ISSR引物大多是基于双核苷酸重复序列所设计的，长度约20bp，在引物的3'端或5'端通常加上2--4个随机选择但通常是简并的核苷酸，如（AC)nX，（TG)nX等。

14.ISSR的特点

1）ISSR检测的是基因组中两个SSR之间的一段短的DNA序列上的多态性。 2）采用单引物扩增，但所用引物长度在2bp左右。 3）所需DNA样品量少，对DNA质量要求不高。

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4）ISSR具有物种特异性。 5）共显性遗传。 15.EST的优势

1）如果发现1个EST标记与一个有益性状在遗传上是连锁的，它很可能直接影响这一性状。

2）那些与某些候选基因或特定组织中差异显示的EST具有同源性的EST，能够成为遗传作图的特殊目标。

3）EST来源于编码DNA，通常其序列保守性程度较高，对于某一个缺少DNA序列资料的特定物种，来源于其他种的EST也可作为有用的遗传图谱制作基础来使用。

第四章

一．作图群体的发展 1.亲本的选择

1）亲本之间的多态性 2）亲本的純合性 3）杂交后代的育性

4）亲本及其F1细胞学特性 2.分离群体的类型

1）暂时性分离群体：包括F2.F3.F4.BC.三交群体等，这类群体中分离单位是个体，一经自交或近交其遗传组成就会发生变化，无法永久使用。

2）永久性分离群体：包括RIL.DH等，这类群体中分离单位为株系，不同株系之间存在基因型的差异，而株系内个体之间的基因型是相同且純合的，自交后不会发生分离，因此可通过自交或近交繁殖后代，而不会改变群体的遗传组成，可以永久使用。 3.F2群体的特点

1）优点：①群体容易产生②群体分离复合孟德尔规律③基因型（带型）容易识别

2）缺点：①非永久性群体，难以长期保存②每个个体提供的DNA数量有限③存在杂合基因型，对显性标记将出现信息简并④表型鉴定误差大，特别是对于数量性状而言

4.BC1（回交）群体的特点

1）优点：①群体容易产生②直接反映了F1代配子的分离比例，作图效率高③适合亲缘关系较远的亲本

2）缺点：①非永久性群体②当显性标记时，表现型和基因型鉴定都有麻烦③对人工杂交困难的植物，不易建立大的群体，且易出现假杂种 5.RIL（重组近交系）群体的特点

1）优点：①永久性群体，可重复使用②以品系作为分离单位，表现型鉴定较可靠

2）缺点：①群体不易产生②群体通常出现偏态分离，这是在群体发展过程中自然选择和人工选择的结果

6.DH（双单倍体）群体的特点

1）优点；①永久性群体，可重复使用②群体分离通常符合孟德尔规律③以品系作为分离单元，表现型鉴定较可靠

2）缺点：①群体不易产生②花粉培养过程可能会对基因型产生选择和引起变异

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7.群体大小的确定

群体类型：达到相当的作图精度，所需群体大小的顺序为F2>RIL>BC1>DH。 二．图谱的完善

1.遗传图谱饱和度：单位长度染色体上已定位的标记数或标记在染色体上的密度。 连锁框架图：标记平均间隔≤20cM 主基因定位：标记平均间隔10-20cM QTL定位：标记平均间隔<10cM 基因克隆：标记平均间隔<1cM 三．比较基因作图

1.概念：利用一种物种的分子标记对另一物种进行遗传或物理作图。

2.同线性：定位在一个物种的染色体上的两个或多个标记又被定位于另一物种的同源染色体区域上，但这些标记间的相对顺序可变化。

3.共线性：定位在一个物种的染色体上的两个或多个标记又被定位于另一物种的同源染色体区域上，但这些标记间的相对顺序是保守的。 四．基因定位

1.基因定位（Mapping of genes）：是指通过遗传作图的方法，确定基因于遗传标记之间的关系。

2.NIL（近等基因分析法）分析法

1）概念：一组遗传背景相同或相近，只在个别染色体区段上存在差异的株系称为近等基因系（NILs）。

2）原理：利用NIL寻找质量性状分子标记的基本策略是比较NIL及其轮回亲本之间的标记基因型，当NIL与供体亲本具有不同的标记基因型时，则该标记就有可能与目的基因连锁。

3.BSA（群体分离分析法）分析

1）概念：是从近等基因系分析法演化而来的，它克服了许多作物没有或难以创建相应的NIL的，在自交和异交物种中均有广泛的应用前景。

2）原理：在作图群体中，依据目标性状表型的相对差异（如抗病与感病，可育与不育等），将个体或株系分成两组，分别将两组中的个体或株系的DNA等量混合，形成相对的DNA池（Pool）。

第五章

1.分子标记辅助选择：借助分子标记对目标性状的基因型进行选择，从而达到提高育种效率的目的，称为分子标记辅助选择（Marker-assisted selection,MAS） 2.标记辅助选择

1）前景选择：标记辅助选择的主要方面是对目标基因的选择，有人称之为前景选择。

2）背景选择：对基因组中其他部分(即遗传背景)的选择称为背景选择。 3）基因聚合（gene pyremiding）：将分散在不同品种中的有用基因聚合到同一个基因组中。

4）基因转移(gene transfer)或基因渗入（gene transgression）:是指将供体亲本（一般为地方品种，特异种质或育种中间材料等）中的有用基因（即目标基因）转移或渗入到受体亲本（一般为优良品种或杂交品种亲本）的遗传背景中，从而达到改良受体亲本个别性状的目的。

5）连锁累赘：在回过程中，目的基因与其附近的非目的基因存在连锁，一起导

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入受体，导致改良的品种与预期的目标不一致，这种现象称连锁累赘。 3.分子标记辅助选择的优越性 1）克服性状表现型鉴定的困难 2）允许早期选择

3）控制单一性状的多个（等位）基因的利用 4）允许同时选择多个性状

5）可进行性状非破坏性评价和选择

6）从育种进程考虑，可加快育种进程，提高育种杂交率 4.分子标记技术在作物育种中的应用 1）用于作物遗传多样性分析 2）遗传多样性研究 3）品种鉴定

4）杂交种子纯度鉴定 5）转基因作物后代的选择 6）目标质量性状的选择 7）目标数量性状的选择

8）回交结合分子标记辅助聚合育种技术 9）分子标记辅助选择与常规育种结合 补充：

1.分子杂交：单链的DNA与RNA，RNA与RNA或DNA与RNA之间通过碱基互补配对原则形成DNA-DNA，RNA-RNA或DNA-RNA的双螺旋结构的不同类型的杂交分子。

2.同义cSNP：SNP所致的编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的含义相同。

3.非同义cSNP：碱基序列的改变可使其翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响了蛋白质的功能。

4.不同分子标记方法比较

遗传方式 多态性 重复性 DNA样品量 可靠性 引物

RFLP 共显性 中 高 2-30ug 高

RAPD 多数显性

高 中等 1-100ug 中等 单，10bp

SSR 共显性 高 高 50-100ug 高 双，20bp

ISSR 共显性 高 高 2-50ng 高 单，20bp

AFLP 多数显性 非常高 高 100ng 高

双，20bp左右

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